Характеристика новых генов Schizosaccharomyces pombe dds20+ и rlp1+, участвующих в клеточном ответе на повреждения ДНК

• Автор: Салахова, Альбина Фаатовна
• Шифр специальности: 03.00.26
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 126 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИИ.

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1. Делящиеся дрожжи ЗсЬцозассЬаготусез ротЬе как модельный объект в молекулярмо генетических исследованиях.
2.2. Рекомбинационная репарация как основной механизм исправления двуцепочечных разрывов ДНК в эукариотических клетках

2.3. Характеристика генов, участвующих в механизме рекомбинационной репарации

ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

3.1. Штаммы, использованные в работе.

3.2. Ростовые среды

3.3. Генетические скрещивания.

3.4. Выделение плазмидной ДНК из клеток Е.соН

3.5. Электрофорез ДНК в агарозном геле.
3.6. Трансформация клеток штамма Е.соН ОН5сс.
3.7. Трансформация клеток 5. ротЬе.
3.8. Выделение ДНК из агарозного геля
3.9. Тесты на клеточный ответ на генотоксический стресс
3 Полимеразная цепная реакция
3 Конструирование делецнонного мутанта З
3 Выделение белка Оск из клеток й.ротЬе.
3 Электрофорез белков в полиакриламидном геле
3 Тест на эффективность менотнчсской виутригеиной рекомбинации.
3 Тест на эффективность мейотичсской межгенной рекомбинации.
3 Определение выживаемости спор.
3 Определение эффективности споруляции.
3 Тесты на белокбелковые взаимодействия.
3 Манипуляции с ДНК
3 Иммунофлуоресцентная микроскопия.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
4.1. Ос1з высококопийный супрессор нарушения репарации клеток, лишенных
ротЬе Яас1 паралогов ЯИр 1аср и Ю1р Кас7р
4.2. Конструирование делеционного мутанта с1йаг3.
4.3. Чувствительность мутантных клеток ША к генотоксическому стрессу
4.4. с1к эпистатичен га8 и гайбО, и является высококопийным
супрессором репликационных и репарационных дефектов мутанта гси
4.5. Обя не играет существенной роли в возобновлении остановленной
репликации и в переключении типа спаривания
4.6. Ос1з участвует в СЫнезависимом механизме толерантности УФ повреждений ДНК
4.7. Уровень потери хромосомы и митотической рекомбинации не изменен в мутанте .
4.8. Менотическая рекомбинация снижена в мутанте 1с1.А.
4.9. Обз является ядерным белком, взаимодействующим с Кйр 1аср.
4 Повторы РОЛ необходимы для функции белка Ос1.
4 Ген г4 кодирует новый КесАподобный белок 5. ротЬе с высокой гомологией к белку человека ХЯСС2
4 Конструирование делеционного штамма Нр1.
4 Нр1 является ДНК репарационным геном, действующим в одном пути репарации с гИр, гкр и гИр
4 Шр1р не играет существенной роли в репарации повреждений ДНК, вызванных действием УФ света и в клеточном ответе при повреждениях репликационных вилок.
4 Спонтанная митотическая внутрихромосомиая рекомбинация в мутанте
4 Мейоз и переключение типа спаривания в мутанте г1р1.
4 Дрожжевой двугибридный анализ взаимодействия Я1р1 с другими белками рекомбинационной репарации.
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
5.1. Яаб зависимые механизмы рекомбинационной репарации
5.2. Ос1 и толерантность к повреждений ДНК, вызванных действием УФ света
5.3. Повторы РОЛ и возможная роль белка ОсЬ в репарации двуцепочечных разрывов ДНК.
5.4. К1р 1 является новым паралогом Ка1 в делящихся дрожжах
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Так же в этой работе мы охарактеризовали другой ген г1рГ, идентифицированный в делящихся дрожжах. Этот геи кодирует белок структурно схожий белкам Ясс А семейства, и таким образом, он является третьим паралогом 1 в 5. Ье, помимо белков КИр и Шф. Настоящая работа выполнена в лаборатории Молекулярной генетики репарации ДНК Института биологии гена РАН. Автор выражает благодарность своим научным руководителям Башкирову Владимиру Ивановичу и Хасанову Фуату Каримовичу за профессиональное руководство, Паршенковой Ольге Анатольевне за техническую помощь и всем сотрудникам лаборатории Молекулярной генетики репарации ДНК за помощь в выполнении этой работы. ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Делящиеся дрожжи i как модельный объект и молекулярногенетических исследованиях. Делящиеся дрожжи i и почкующиеся дрожжи vii получили в последнее время широкое распространение в качестве модельных объектов при изучении процессов метаболизма ДИК, таких как репарация, рекомбинация и репликация ДНК. Большой интерес к дрожжам объясняется сходством их генов гомологов с генами, обнаруженными в клетках высших эукариотических организмов, в том числе и у человека, кодирующих белки со схожими функциями. Так, многие консервативные гены дрожжей, регулирующие рост, деление клеток и репарацию ДНК, были найдены и у человека, где оказались ответственными за переход нормальной клетки в раковую клетку. Это породило всплеск изучения этих генов у дрожжей, как более простых и удобных систем для их анализа. Как и следует из названия, делящиеся дрожжи растут и делятся не так, как почкующиеся дрожжи. Их клетки имеют стержнеобразную форму, растут в длину без изменения диаметра и делятся с образованием клеточной перегородки по середине клетки. В течение митотического цикла три хромосомы . В обоих видах дрожжей митоз и мейоз протекают без разрушения ядерной оболочки. Клетки как делящихся, так и почкующихся дрожжей, могут конъюгировать между собой и сиорулировать с последующим вхождением в мейоз. Отличие между ними заключается также и в том, что большую часть своего жизненного цикла клетки . Их клетки начинают конъюг ировать лишь только тогда, когда они начинают голодать, а образовавшиеся после споруляции диплоидные клетки вступают в мейоз. Заставить . Дрожжи . Бремя удвоения клеток составляет часа, и очень удобны как для генетического и молекулярного анализа, так и для изучения их клеточного цикла. Быстрый рост клеток, наличие гаплоидной фазы жизненного цикла, возможность анализа всех четырех продуктов мейоза, простота генетического, комилементационного и эпистатичсского анализа вс это делает дрожжи удобным модельным объектом для исследования клеточных путей репарации ДНК в клетке. Делящиеся дрожжи эволюциоино так же удалены от почкующихся дрожжей 5. Медиальное деление клеток, интронная и экзонная организация генома, сплайсинг РНК, контроль клеточного цикла и эффективная незаконная рекомбинация вс эго у 5. Ье более сходно с клетками позвоночных, чем с 5. Примечательно, что клетки 5. Ье значительно устойчивее к ультрафиолету и ионизирующей радиации, чем клетки 5. Это позволяет предполагать, что их механизм репарации ДНК более эффективен. Более того, делящиеся дрожжи, помимо механизма эксцизионной репарации, имеют добавочный механизм устранения повреждений ДНК, вызванных действием УФ света, инициируемый эндонуклеазой иУЭЕ. Гаплоидные клетки 5. Ъе в фазе С2 клеточного цикла более устойчивы к ультрафиолет и ионизирующей радиации, чем в фазе С. В фазе в2 клеточного цикла делящихся дрожжей наличие двух копий ДИК благоприятствует процессу рекомбинационной репарации повреждений ДНК. Значительная продолжительность фазы в2 клеточного цикла у 5. Ье времени клеточного цикла и участие рекомбинационной репарации в восстановлении двуцепочечных разрывов ДНК при действии ионизирующей радиации, и повреждений ДНК, вызванных УФ светом, повиднмому, обеспечивают более высокую радиационную устойчивость этих клеток в сравнении с клетками 5. Рекомбинационная репарация как основной механизм исправления двуцепочечных разрывов ДНК в эукариотических клетках.