Организация транспорта белков через комплекс Гольджи

• Автор: Безнусенко, Галина Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 268 с. : 28 ил.

СОДЕРЖАНИЕ
Список используемых сокращений. Введение общая характеристика работы Глава 1. Обзор литературы.

1.1 Основные модели транспорта через комплекс Гольджи

1.1.1 Модели диссоциации.

1.1.2 Везикулярная модель

1.1.3 Модель прогрессии

1.1.4 Модель прогрессии и созревания цистерн.

1.1.5 Модель созревания и профессии переносчика транспортируемого белка.

1.1.6 Диффузионная модель или модель непрерывных

коммуникаций

1.1.7 Модель болюса
1.2 Транспорт от эндонлазматического ретикулюма к комплексу Гольджи
1.3 Механизмы транспорта через комплекс Гольджи
1.3.1 Транспорт белков через комплекс Гольджи согласно везикулярной модели
1.3.2 Этапы переноса белков через комплекс Гольджи по модели созревания и профессии цистерн.
1.3.3 Процесс транспорта белков через комплекс Гольджи согласно модели созревания и прогрессии мембранного переносчика.
1.3.4 Транспорт белков через комплекс Гольджи по механизму латеральной диффузии.
1.3.5 Комбинированные модели о транспорте белков через комплекс Гольджи
1.4 Транспорт от комплекта Гольджи к плазматической мембране.
1.4.1 Везикулярный транспорт от комплекса Гольджи согласно везикулярной модели
1.4.2 Транспорт от комплекса Гольджи в специальных мембранных переносчиках по модели созревания и прогрессии цистерн
1.4.3 Непрерывность коммуникаций и транспорт от комплекса Гольджи по модели латеральной диффузии.
1.4.4 Регулируемая непрерывность и последовательные слияния согласно модели созревания и прогрессии переносчика на этапе транспорта от комплекса Гольджи к плазматической
мембране.
Глава 2. Материалы и методы
2.1 Клеточные линии, ДНКкопструкции, антитела и химические реагенты.
2.2 Условия роста культуры клеток
2.3 Трансфекция
2.3.1 Трансформация бактерий с помощью температурного шока высокой температуры
2.3.2 Длинный путь приготовления плазмидиой ДНК
2.3.3 Трансфекция клеток путем электропорации
2.4 Инфицирование клеток вирусом везикулярного стоматита vi ii vi, VV
2.5 Синхронизационные протоколы
2.6 Иммунофлуоресцентная микроскопия.
2.6.1 Материалы, использованные для проведения иммунофлуоресцентной микроскопии
2.6.2 Метод проведения иммунофлуоресцентного специфического окрашивания
2.6.3 Метод измерения уровня колокализации иммунофлуоресцентных протеинов.
2.7 Конфокальная микроскопия.
2.8 Электронная микроскопия
2.8.1 Материалы, использованные для проведения обычной
электронной микроскопии, так же в сочетании с иммуномечением.
2.8.2 Метод приготовления образцов для электронной микроскопии.
2.8.3 Способы улучшение контраста
2.8.4 Методы иммуномечения препаратов для электронной микроскопии ЕМ перед заключением в эпоксидные смолы
2.8.4.1 Метод золотого усиления
2.8.4.2 Диаминобензидиновая реакция ДАБреакция
2.8.4.3 Двойное окрашивание
2.8.5 Методы иммуноцитохимии после заключения постэмбеддинг. Криосрезы
2.8.5.1 Материалы, использованные для приготовления криосрезов и их иммуномечения.
2.8.5.2 Получение ультратонких криосрсзов
2.8.5.3 Иммуномечение криосрезов.
2.8.6 Морфометрический анализ
2.8.7 Метод быстрого замораживания и криозамещения.
2.8.8. Электронная томография
2.8.9. Коррелятивная микроскопия.
2.9 Приложение к главе 2. Таблицы использованных антител.
Результаты исследований. Глава 3.
Маленькие белки карго и большие агрегаты могут проходить через Гольджи, используя общи механизм, не покидая просвета цистерны.
3.1 Разработка экспериментальной системы для мониторинга процесса транспорта УБУв и проколлагена I в одной и той же клетке
3.2 Разница в скоростях проколлагена1 и УЗУв при проходе через Гольджи комплекс неразличима.
3.3. Агрегаты лроколлагена1 проходят через комплекс Гольджи, не
покидая просвета цистерн, и не в мегавезикулах
3.4 Молекулы вируса У8Ув транспортируются через стопку цистерн без физического прохождения из цистерны в цистерну и без
вхождения в Гольджи везикулы
3.5. Обсуждение.
3.5.1 Кинетические и механистические доказательства существования единого механизма транспорта для проколлагена1 и УБУ в.
3.5.2 Природа транспортного механизма.
3.6 Приложение к главе 3. Рисунки, подписи к рисункам.
Ферменты комплекса Гольджи исключаются из СОР1 везикул н концентрированы в перфорированных зонах Гольджнцистер и.
4.1 Ферменты аппарата Гольджи исключаются из круглых профилей, расположенных около Гольджи и имеющих диаметр от до им
4.2 Блокирование слияния мембран не приводит к накоплению везикул, обогащенных ферментами.
4.3 СОР Iзависимые везикулы полученные i vi обеднены ферментами Гольджи
4.4 Перфорированные зоны цистерн обогащены ферментами Гольджи.
4.5 Обсуждение
4.5.1 Перфорированые зоны цистер Гольджи и расположенные около них тубулы являются зонами концентрации Гольджи ферментов.
4.5.2 Роль перфорированных зон в транспорте через Гольджи комплекс
4.5.3 Возможные механизмы внутриГольджи транспорта с учетом факта низкой концентации ферментов в везикулах
4.6 Приложение к главе 3. Таблицы и подписи к таблицам, рисунки и подписи и рисункам
Заключение.
Выводы
Список литературы


Механизмы ретроградного транспорта, которые включают в себя транспорт от плазматической мембраны к трансГольджи, от трансГольджи к цисГольджи, от цисГольджи к ЭР, так же как и транспорт от эндосом к трансГольджи и эндоцитоз в целом не является предметом рассмотрения в данной работе. Эти механизмы заслуживают отдельного анализа, и включение их в рассматриваемые комбинации сделало бы количество моделей еще более многочисленным. Основные модели транспорта через комплекс Гольджи. Модели диссоциации. Диссоциационные модели предусматривают, что экзоцитозный компартмент существует стабильно и изолированно. Специализированные маленькие значительно меньше, чем сам компартмент переносчики карго формируются на проксимальном т. ЭР на протяжении всего биосекреториого пути компартменте, отсоединяются от этого компартмента и доставляются простой диффузией через цитозоль или с участием моторов цитоскелета в следующий, но более дистальный более близкий к ПМ компартмент, после чего присоединяется и сливается с ним. Отделение мембраны транспортного переносчика карго от мембраны проксимального компартмента происходит перед слиянием с дистальным. Таким образом, между стабильно существующими компартментами не возникает непрерывного сообщения определенный момент времени. Везикулярная модель. Так называемая везикулярная модель Раасе в. Койшап ТЕ. Шейка бада схлопывается, и сформированная таким образом везикула, отщепляясь, теряет свое белковое покрытие, затем, перемещается и сливается с дистальным компартментом. Вначале везикулярная модель базировалась на экспериментах с изолированными экзоцитозными клатринпокрытыми везикулами КоЬтап ГЕ. Щ а. Спротсин вируса везикулярного стоматита УБУв, в качестве каргопротеина, транспортировался через минут после отпуска транспортного блока в так называемой ранней волне в клатринпокрытых везикулах и был определен в виде высокоманнозной формы, в то время как вовторой, поздней волны минут после отпуска содержалась зрелая, комплексная форма. Предполагалось, что транспорт УБУв на ранней волне осуществляется в клатринпокрытыми везикулах из ЕР к Гольджи комплексу, а следующая, поздняя волна отражает последующий транспорт от Гольджи к ПМ КоОшап Д. Е. с а. Однако, после открытия другого плотного покрытия СОР I покрытия Огс с а. Гольджи переносчиков была предложена уже для СОРГзависимых везикул. С другой стороны, было так же продемонстрировано, что через минут слияния двух или болсс клеток одна из которых VVинфицирована, а другие не инфицированы и формирования гетсрокариона, VV якобы был способен двигаться от остатка Гольджи инфицированной клетки к остатку Гольджи неинфицированной . Эти результаты были интерпретированы как подтверждение того, что везикулярные переносчики карго Iокаймлснные везикулы способны свободно диффундировать через цитозоль гетерокариона от Гольджи одной клетке к Гольджи другой клетки. Однако группа исследователей, описавших данный феномен i . В последние годы последователи данной теории драматически изменили везикулярную модель на уровне комплекса Гольджи и предложили модель фильтрующих везикул i . По данной модели каргосодержащие СОР Iвезикулы могут перемещаться вверх и вниз по стопке цистерн и пристыковываться к той ли иной цистерне в зависимости от композиции белков слияния , учитывая, что бслки предопределяют слияние мембран Мауег Т. Модель прогрессии. Модель профессии подразумевает, что большие сопоставимые по размерам с цистернами Гольджи домены, наполненные транспортируемым материалом карго, формируют проксимальный компартмент и транспортируются как мембранный транспортный переносчик карго к дистальному компартменту на протяжении биосскреторного пути. Такие транспортные переносчики карго могут быть производными ЭР i Н. Р. i А, или возникают как мегавезикулы, сформированные из цистерн Гольджи V . В. . Начальная версия сценария профессии предполагала, что мембраны текут в одном направлении и ассоциированные с этим потоком мембран продукты секреции перемещаются в том же потоке Т, . Оригинальная модель давала основание предполагать, что не только цистерны комплекса Гольджи имеют одинаковую концентрацию резидентных Гольджиферментов, но даже и плазматическая мембрана клетки содержит данные ферменты в достаточно большом количестве.