Роль кинетохорассоциированного белка CENP-E в митотическом делении клеток млекопитающих

• Автор: Ладыгина, Надежда Григорьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 107 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Глава 1. Процесс прикрепления хромосом к микротрубочкам веретена деления.

1.1 Организация митотического веретена деления.

1.2 Инициация взаимодействия между микротрубочками и кинетохорамн митотических хромосом

1.3 Передвижение хромосом во время прометафазы

1.4 Динамика микротрубочек веретена деления в процессе митоза.

Глава 2. Механизм передвижения митотических хромосом.

2.1 Роль белковбиологичсскнх моторов в процессе передвижения хромосом

2.2 Турновер микротрубочек в процессе передвижения хромосом.
Глава 3.Значение взаимодействия между .микротрубочками и кинетохорами в регуляции митотической прогрессии.
3.1 Точка перехода митоза.
3.2 Сборка компонентов системы точки перехода на кинетохорс.
3.3 Динамика компонентов митотической точки перехода
Глава 4. Кинстохорассоциированный белок Е СЕЫРЕ.
4.1 Роль белка СЕЫРЕ в передвижении хромосом во время митоза.
4.2 Роль белка СЕЫРЕ в регуляции расхождения хромосом
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1.Полимеразная цепная реакция и ПЦРмутагенсз.
2. Культивирование клеточных линий НеЬа, НсЬа СБР Н2В 7.1 и НеЬа ОБР атубулин
3. Трансформация клеток и иммуноокрашивание слайдов
4. Микроиньекции ДНК и цейтраферная фотосьемка
5. Реакция трансляции i vi
6. Исследование способности связывать микротрубочки.
7. ПАЛГ и иммуноблоттинг
8. Реакция иммунопреципитации и киназная реакция
9. Анализ состояния клеточного цикла
Приложение 1. Технология клонирования
Приложение 2. Технология ii короткошпилечные РНК.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Восстановление полноразмерной копии кДНК гена , создание кшРНК Е экспрессирующего вектора 3x и кшРНК резистентной аллели 1.
2. Значение каждого из мнкротрубочкосвязывающих доменов для функционирования i viv
2.1 НИгтерминальмый микротрубочкосвязывающий домен.
2.2 СООНтерминальный микротрубочкосвязывающий домен
2.3 Эффекты потери двух мнкротрубочкосвязывающих доменов
3. Значение фосфорилирования СЕЫРЕ в процессе митоза
4. Оценка напряженности на кинетохорах сестринских хромосом при нарушении микротрубочкосвязывающей активности СЕЫРЕ или его регуляции.
5. Функциональные основы взаимодействия СЕИРЕ с киназой митотической точки рестрикции ЬВиВЯ
БЛАГОДАРНОСТИ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Впервые выявленные в дрожжевых клетках белки МТР являются высоко консервативными в эволюционном плане. Гомологи дрожжевых I, 3, 1, 2, 3 и белков были идентифицированы у высших организмов, где также была показана их роль в регуляции митотической точки рестрикции. Характерной чертой представителей этой группы белков является их локализация на кинетохоре, где, как предполагается, они регулируют активность последних в процессе выстраивания хромосом. Наличие в клетке неприкрепленного к микротрубочкам веретена деления кинетохора вызывает увеличения плотности сигнала белков МТР на подобной хромосоме, что еще раз подтверждает, что белки митотической точки рестрикции чувствительны к взаимодействию кинетохоров и микротрубочек. На этапе, когда хромосома достигает состояния метафазного выравнивания, такие белки точки перехода как 1 и 2 полностью покидают кинетохоры, в то время как сигнал I и уменьшается в несколько разСЬап, i . Расхождение хромосом осуществляется и отчасти контролируется белкамибиологичсскими моторами, локализующихся на кинстохорах клетки. Представителем данной группы является кинезиноподобный i i Е белок, обеспечивающий формирование контакта между кинетохором и микротрубочками МТ. В структуре данного белка отмечают два микротрубочкосвязывающих домена, расположенных на 2 и СООНконцах, роль которых на сегодняшний день остается до конца не изученной кинетохорсвязывающий домен, а также домен взаимодействия с белками митотической точки рестрикции, в частности киназой . Функциональные исследования показали, что активность этого белка регулируется системой митотической точки рестрикции. Молекулярная связь с системой точки рестрикции была показана на примере прямого взаимодействия данного белка с киназой, гомологичном 3 и 1 белкам точки рестрикции почкующихся дрожжей. И что наиболее важно, было показано, что митотический арест, индуцируемый отсутствием , зависит от киназной активности . Учитывая все вышеприведенные результаты и тот факт, что также локализуется на кинетохоре, можно предположить, что и являются неотъемлемой частью мехаиосснсерного комплекса, который связывает функционирование кинетохоров и системы точки рестрикции. В дайной работе будут рассмотрены некоторые из аспектов функционального значения доменной структуры белка , механизмы регуляции его активности и определена роль взаимодействия данного белка с белками митотической точки рестрикции, в частности киназы . Всесторонняя оценка активности данного белка в процессе митоза позволит использовать его в качестве избирательной мишени при лечении онкологических заболевании автору представляется, что потеря клетками данного вызывает арест быстро делящихся раковых клеток, а также внесет вклад в понимание механизма атипичных митозов. Цель и задачи работы. Цель данной работы изучить роль белка в процессах прикрепления кинетохоров сестринских хроматид к микротрубочкам веретена клеточного деления, хромосомной конфессии и прохождения митотической точки рестрикции в делящихся культивируемых клетках млекопитающих . Восстановить полноразмерную 8 кб кДНК копню гена из имеющихся перекрывающихся фрагментов. Показать i vi и i viv, что полученная в процессе работы кДНК гена является функциональным гомологом эндогенной формы. Используя технологию короткошпилечных интерферирующих РНК для ингибирования активности эндогенного белка, оценить i viv роль каждого из двух микротрубочкосвязывающнх доменов в процессе митоза и эффект удаления двух МТсвязывающнх доменов одновременно. Описать значение АТФазной активности ЫШтсрминального района в процессе внутриклеточного турновера данного белка. па протяжении митотического цикла клетки. Картировать район взаимодействия и киназы митотической точки рестрикции 1 и охарактеризовать i viv роль подобного взаимодействия для завершения клеткой митотического деления.