Реорганизация системы микротрубочек в ходе эндоцитоза ЭФР-рецепторных комплексов в интерфазных клетках

• Автор: Харченко, Марианна Викторовна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 100 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
1. ВВЕДЕНИЕ

2. ЦЕЛЬ И ЗАДАЧИ ИССЛЕДОВАНИЯ

3. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

3.1. Внутриклеточный везикулярный транспорт

3.2. Типы эндоцитоза

3.3. Эндосомы

3.4. Эндоцитоз, опосредованный рецептором ЭФР

3.4.1. ЭФР и его рецептор

3.4.2. Динамика эндоцитоза, опосредованного рецептором ЭФР

3.4.3. Сортировка молекул в ПЭ

3.5. Участие цитоскелета в регуляции эндоцитоза
3.6. Микротрубочки
3.7. Белки, взаимодействующие с микротрубочками
4. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ
4.1. Культивирование клеточных линий
4.2. Лиганды и их производные
4.3. Антитела
4.4. Обработка клеток цитохалазином Р
4.5. Обработка клеток буфером для экстракции растворимых цитоплазматических белков
цитоскелетным буфером
4.6. Исследование динамики эндоцитоза
4.7. Субклеточное фракционирование в градиенте
плотности ного Перколла
4.8. Определение степени деградации лиганда
4.9. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток
4 Лазерная сканирующая конфокальная микроскопия
4 Измерение интенсивности флуоресценции антител,
связанных с тубулином, в цитоплазме клеток
4 Воспроизводимость экспериментов
5. РЕЗУЛЬТАТЫ
5.1. Реорганизация тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов
5.2. Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках с разной скоростью эндоцитоза
5.3. Количественный подход к характеристике разных типов реорганизации системы МТ
5.4. Чувствительность МТ к экстракции изменяется в ходе эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов
5.5. Ацетилированность тубулина изменяется в ходе эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов
5.6. Зависимость реорганизации сети МТ от других типов цитоскелета
5.7. Реорганизация тубулинового цитоскелета в клетках, экспрессирующих мутантные формы рецептора ЭФР
6. ОБСУЖДЕНИЕ
7. ВЫВОДЫ
8. Список цитируемой литературы
Список сокращений
АО аминокислотный остаток БСА бычий сывороточный альбумин Лиз лизосома
МВЭ мультивезикулярная эндосома
МТ микротрубочка
ПМ плазматическая мембрана
РОЭ эндоцитоз, опосредованный рецептором
РЭ ранняя эндосома
ПЭ поздняя эндосома
ТК тирозинкиназа, тирозинкиназный ая
ЦБ цитоскелетный буфер
ЭПР эндоплазматический ретикулум
ЦОМТ центр организации микротрубочек
зеленый флуоресцирующий белок
фосфатносолевой буфер
серии
Туг тирозин
1. ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Эндоцитоз один из видов везикулярного транспорта, присущего всем эукариотам. В случае эндоцитоза, опосредованного рецептором, лиганд взаимодействует со своим рецептором, находящимся на плазматической мембране, и образовавшийся лигандрецепторный комплекс поступает внутрь клетки интернализуется. Затем комплексы либо рециклируют на плазматическую мембрану, либо деградируют в лизосомах. Лигандрецепторные комплексы, направляемые на деградацию, переходят в поздние мультивезикулярные эндосомы МВЭ, локализованные в околоядерной области. В этой части клетки зрелые МВЭ взаимодействуют с лизосомами. Считается, что такие перемещения происходят с участием компонентов цитоскелета, в том числе, микротрубочек МТ. Это предположение получило в дальнейшем множество подтверждений. Были идентифицированы белки, обеспечивающие взаимодействие эндосом с плюсконцами МТ и движение везикул в сторону центра организации МТ ЦОМТ, такие как I0, динеиндинактиновый комплекс, белки и др. . . Vi . i . Перемещения эндосом с периферии клетки в околоядерную область не происходит после обработки клеток агентами, разрушающими МТ v . Соколова и др. Xi . Данные различных исследователей о роли МТ в эндоцитозе чрезвычайно противоречивы. i . Xi В других работах этот факт ставится под сомнение i . . Соколова и ДР. Клетки, экспрессирующие рецепторы эпидермального фактора роста ЭФР, широко используются для изучения эндоцитоза, передачи внутриклеточного сигнала, а также взаимосвязи этих двух процессов. За последние два десятилетия были идентифицированы многие белки, участвующие в регуляции эндоцитоза на разных этапах такие, как адалтерный белок , убиквитинлигаза сСЫ, малые ГТФазы 5 и 7, фосфатидилинозитол3киназы и др. Выяснены также некоторые механизмы сортировки. Однако морфология тубулинового цитоскелета после стимуляции эндоцитоза до сих пор не изучалась, поскольку предполагалось, что радиальная сеть МТ в ходе эндоцитоза принципиально не меняется. В ходе наших исследований роли фосфатидилинозитол3киназ 1го класса в регуляции эндоцитоза было показано, что эти молекулы ассоциируются с внутриклеточными структурами, отличными от эндосом Железнова и др. Эти структуры находятся в области ЦОМТ совместно с МТ. В дальнейшем мы впервые описали перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза, связанные с нарушением радиального расположения МТ. Мы впервые показали, что радиальная сеть МТ претерпевает последовательные изменения в ходе эндоцитоза. Впервые выявлена связь между стадиями эндоцитоза и архитектурой тубулинового цитоскелета. Впервые продемонстрировано, что радиально расположенные МТ на ранних и на поздних стадиях эндоцитоза отличаются по свойствам. Цель настоящей работы выявить основные закономерности перестройки тубулинового цитоскелета в ходе эндоцитоза рецептора ЭФР.