Роль марк- и PI3K-зависимых сигнальных каскадов в регуляции пролиферации эмбриональных стволовых клеток мыши

• Автор: Лянгузова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил.

Оглавление
Оглавление
Введение

Актуальность проблемы

Цель и задачи исследования

Обэор литературы

Эмбриональные стволовые клетки

История получения эмбриональных стволовых клеток

Происхождение и основные свойства ЭСК мыши плюрипотентность и самообновление

Молекулы, необходимые для поддержания недифференцированного состояния ЭСК.

I3 путь
Транскрипционный фактор 34
Транскрипционный фактор
Клеточный цикл
Структура клеточного цикла
Регуляция активности циклинзависимых киназ
Регуляция перехода 1 ростовыми факторами
Особенности пролиферации ЭСК
РКзависимый путь
Общее описание
Фосфатаза негативный регулятор РКзависимого пути
Семейство I3
I3 I класса
I3 II класса
I3 III класса
Ингибиторы I3киназы
Вортманнин
Киназа ключевое звено в передаче сигнала от I3
Механизмы, которые обеспечивают антиапоптотическое действие киназы
Механизмы, с помощью которых киназа стимулирует пролиферацию
РКзависимый путь в ЭСК.
Роль I3 в поддержании недифференцированного состояния ЭСК
Роль фосфатазы
ЭСКспецифичный белок
Материалы и методы
Клеточные линии, их культивирование и дифференцировка
Построение кривых роста популяций.
Проточная цитофлуориыетрия ДНК.
Оценка жизнеспособности популяций МТТ тест
Вестернблоттинг.
I vi анализ киназной активности.
Обратная транскрипция и ПЦР.
Анализ экспрессии маркера старения А
Люциферазная активность i vi
Количественная ПЦР
Анализ активности каспазы 3
Результаты
Влияние сывороточного голодания на активность и РКзависимых сигнальных каскадов и структуру клеточного цикла в ЭСК
Влияние ингибиторов сигнальных каскадов на распределение ЭСК мыши по клеточному циклу.
Анализ распределения ЭСК мыши по фазам клеточного цикла при сочетании сывороточного голодания и инактивации и I3зависимых сигнальных каскадов.
Влияние сывороточного голодания и обработки на содержание и активность белков, регулирующих 1 переход в ЭСК мыши.
Анализ влияния инактивации 2 на 1 переход ЭСК мыши
Негативное влияние на рост популяции ЭСК мыши
Индукция апоптотической гибели ЭСК мыши в результате сывороточного голодания и обработки
Сравнение эффектов двух ингибиторов I3 и вортманнина на ЭСК мыши
Дифференцировка ЭСК мыши
Старение ЭСК мыши
Обсуждение
Действие сывороточного голодания на ЭСК мыши
Действие ингибитора РКзависимого каскада ЬУ на ЭСК мыши
Сравнение действия ингибиторов РК 1У и вортманнина на ЭСК мыши
Дифференцировка ЭСК мыши
Заключение
Выводы
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Список цитированной литературы


В ЭСК мыши фаза 1 очень коротка, и период чувствительности к митогенным сигналам извне в ней, повидимому, редуцирован. Вероятно, пролиферацию ЭСК мыши стимулирует независимая от внешних сигналов митогенная активность, которая постоянно поддерживает циклинзависимые киназы и транскрипционный фактор 21 в активном состоянии. Какие сигнальные молекулы и каскады обеспечивают эту активность пока еще неизвестно. Из исследований клеток других типов известно, что митогенный сигнал от ростовых факторов к регуляторам клеточного цикла передают МАРЕгк киназный каскад и РКзависимый каскад , , . В связи с этим данные сигнальные пути представляются вероятными кандидатами на роль источников внутренней митогенной активности в ЭСК мыши. Целью настоящей работы было изучение вклада активностей МАРК и I3зависимых каскадов в регуляцию перехода 1 в митотическом цикле эмбриональных стволовых клеток мыши. РКзависимого сигнального пути. В году две независимые группы исследователей сообщили об успешном выведении в культуру клеток внутренней клеточной массы бластоцисты мыши i v . Полученные культуры стали называть линиями эмбриональных стволовых клеток ЭСК. Оказалось, что при соблюдении оптимальных условий культивирования ЭСК могут пройти неограниченное число пассажей i vi, не теряя при этом своих свойств. Сегодня получение ЭСК мыши хорошо отработанная методика, детально описанная во многих пособиях и снабдившая экспериментаторов множеством линий ЭСК мыши например, , i, . Вслед за мышью, были получены линии ЭСК других млекопитающих, в частности, крысы, кролика, обезьяны и человека . . . . Однако наибольшего прогресса в исследованиях ученые добились именно с ЭСК мыши. В году было показано, что с помощью гомологичной рекомбинации можно создавать сайтспецифические мутации в геноме ЭСК мыши и i, . Двумя годами позже Коллер и соавторы обнаружили, что при инъекции генетически модифицированных ЭСК в бластоцисту такая сайтспецифическая мутация в их работе в гене , xi i может передаваться по наследству . Теперь эта технология с применением стволовых клеток широко используются для получения трансгенных мышей с целью исследования роли различных генов i viv. Мощная волна популярности стволовых клеток возникла после успешного выведения в культуру в году ЭСК человека, так как чрезвычайно привлекательной представляется перспектива прикладного использования этих шпорипотентных клеток в медицинских целях, а именно получение из них дифференцированных клеток и тканей различных типов для лечения заболеваний, репарации поврежденных органов, а также для тестирования лекарств. На стадии развития 4,0 3,5 день развития бластоциста мыши еще не имплантирована в стенку матки, она только высвобождается из оболочки зоны пеллюцида. На этом этапе бластоциста состоит из двух популяций клеток иллюстрация 1. Наружный слой, трофоэктодерму трофобласт, составляют терминально дифференцированные клетки трофобласты, которые в дальнейшем участвуют только в формировании плаценты, и не принимают участия в образовании тела зародыша. Внутри бластоцисты располагается так называемая внутренняя клеточная масса ВКМ. Из клеток ВКМ в последующем развивается вс тело зародыша. Столь широкий дифференцировочный потенциал клеток ВКМ а они дают начало всем типам клеток многоклеточного организма называют плюрипотентностью от лат. Именно клетки ВКМ при создании благоприятных условий i vi интенсивно пролиферируют, выселяясь из разрушающейся бластоцисты и давая в результате линию ЭСК иллюстрация 2 i, . Иллюстрация 1. Фотография бластоцисты до стадии имплантаци, фазовый контраст. Фотография взята с сайта . Иллюстрация 2. Клетки внутренней клеточной массы бластоцисты дают начало линии плюрипотентных эмбриональных стволовых клеток схема из пособия i . i i, США.