Механизмы формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных

• Автор: Боярчук, Екатерина Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 120 с. : ил.

1.1 Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1 Цитоплазматические экстракты ооцитов шпорцсвоП лягушки X vi как модельная система изучения событий клеточного цикла

2.2 Строение и функция кинетохора позвоночных

2.2.1 Центромер

2.2.2 Наружный кннетохор

2.2.2.1 Строение наружного кинетохора

2.2.2.2 Регуляция сборки НК

2.2.2.3 Функции наружного кинетохора

В настоящеем разделе мы рассмотрим механизмы, отвечающие за каждую из этих функций.

2.2.3 Строение и функция внутреннего центромерного домена
2.2.3.1 Транзитный хромосомный комплекс
2.2.3.1.2.1. Роль ТХК в регуляции митотической конденсации и поддержании структуры хромосом
2.2.3.1.2.2 Роль ТХК в регуляции сегрегации хромосом
2.2.3.1.2.3 Роль ТХК в
2.2.3.1.2.4 Роль ТХК в формировании веретена деления
2.2.3.1.2.5 Роль ТХК в цитокинезе
2.2.3.3 Кинезин К
2.2.3.3 Комплекс i2
2.2.3 Регуляция сборки ВЦ Д
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКИ
3.1. Рекомбинантые белки и антитела
3.2. Приготовление цитоплазматического экстракта из ооцитов X. vi
3.3. Очистка хроматина
3.4 Клеточные линии, их культивирование, получение стабильных клеточных линий, РНКинтерференция
3.5. Иммунофлуоресценция и анализ изображений
3.6. Иммунопреципитация и преципнтация
3.7. Вестернблопшг
3.8. Киназная активность i vi
Глава 4. Результаты
4.1 Выбор модели для изучения строения и регуляции формирования
кинетохора
4.2. Регуляция расположения транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене кинетохора
4.2.1. Белок i контролирует расположение транзитного хромосомного комплекса во внутреннем центромерном домене в системе экстрактов ООЦИТО0 X vi
4.2.2. Нарушение расположения ТХК на кииетохорс в отсутствие 1 не связано с задержкой в прохождении митоза.
4.2.3 i контролирует расположение ТХК во внутреннем центромерном домене в соматических клетках
4.2.4 Киназная активность i абсолютно необходима для связывания ТХК с внутренним центромерным доменом.
4.2.5 i контролирует стабильность транзитного хромосомного комплекса
4.2.6 i фосфорилирует I
4.3. Регуляция расположения белка i в ВЦД
4.3.1 Динамика x в ходе клеточного цикла
4.3.2. i контролирует связывание с митотическим хроматином.
4.3.3. Для связывания x с митотическим хроматином не требуется накопления киназы I на кинетохорс
4.3.4 Транзитный хромосомный комплекс необходим для правильного расположения на кинетохоре
4.4 Регуляция расположения кинезина МСАК в ВЦД
4.5 Формирование внутреннего центромерного домена и наружного кинетохора происходит независимо от митотической конденсации хроматина.
Глава 5. ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 6. Заключение
ВЫВОДЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Поиск механизма регуляции сборки внутреннего центромерного домена и являлся предметом данной работы. Целью работы было изучение процесса формирования внутреннего центромерного домена кинетохора позвоночных животных. Выбрать модель, позволяющую изучать формирование кинстохоров позвоночных с применением биохимических методов и приемлемую для дальнейших функциональных исследований. Выявить биохимические пути, которые регулируют формирование внутреннего центромериого домена кинетохора. Выяснить взаимозависимость формирования внутреннего центромерного домена, наружного кинетохора и митотической конденсации хромосом. ГЛАВА 2. Понимание механизмов, лежащих в основе клеточного деления, уже долгое время является одной из основных задач клеточной биологии. Ранние стадии эмбриогенеза были популярной моделью для изучения клеточного цикла начиная с XIX века. Большой размер ооцитов земноводных позволял производить микроинъекции и, таким образом, проводить биохимический анализ различных процессов в ходе клеточного цикла. Однако микроинъекции могут применяться только для изучения ограниченного набора событий клеточного цикла, а наличие желтка в яйцах затрудняет микроскопические исследования многих внутриклеточных событий. Использование системы цитоплазматических экстрактов ооцитов позволило решить обе эти проблемы. В ходе оогенеза позвоночных животных происходит образование незрелых ооцитов, которые остановлены у некоторых видов на несколько лет в профазе I мейоза. При гормональной стимуляции проходит созревание таких ооцитов, и они входят в мейотический цикл. При оплодотворении ооцит завершается второе деление мейоза, в ходе которого образуется гаплоидный пронуклеус, способный к слиянию с мужским пронуклеусом, и формируется диплоидная зигота , . Цитоплазма зрелого ооцита содержит два биохимических фактора фактор, инициирующий созревание англ. Мфазы, ФИМ и цигостатичсский фактор ЦСФ, англ. Рис. Инъекция цитоплазмы зрелых ооцитов в незрелые вызывает созревание последних, т. Это событие регулируется ФИМ, который является комплексом циклин В , . Активация ФИМ индуцирует как мейоз, так и митоз, а его инактивация запускает начало анафазы и последующий переход в интерфазу. В метафазе И мейоза зрелые ооциты останавливаются под действием ЦСФ. При оплодотворении проникновение спермин вызывает выброс ионов кальция из внутренних компартментов ооцита. Повышение цитоплазаматической концентрации Са2 приводит к инактивации ЦСФ и ФИМ, и, следовательно, к завершению ооцитом второго деления мейоза и переходу в ингерфазу. В отличие от молекулярной природы ФИМ, биохимический состав ЦСФ долгое время был неизвестен. АР СС англ. В настоящее время доказано, что основную роль в установлении и поддержании остановки под действием ЦСФ играет белок i2 англ. Iii 2. АР СС. При выходе ионов Са2 i2 быстро деградирует, что приводит к активации АРСС и запуску анафазы i i, , . Рисунок 1. Схема регуляции клеточного цикла в ходе созревания ооцитов лягушки, по , с дополнениями. Полученная центрифугированием цитоплазматическая фракция ооцитов сохраняет все их биохимические особенности. Поэтому система цитоплазматических экстрактов из зрелых ооцитов лягушек позволяет воспроизвести i vi процессы репликации, конденсации и сегрегации хромосом . Среди основных достоинств системы цитоплазматических экстрактов следует отметить их способность поддерживать в течение долгого времени определенную стадию клеточного цикла митоз или интерфазу. Более того, система экстрактов X. Существует несколько типов цитоплазматических экстрактов ооцитов, используемых для исследования событий клеточного цикла. Приготовление цитоплазматических экстрактов из неоплодотворенных яиц в присутствии ЭГГА, позволяет получить так называемые ЦСФэкстракты. При добавлении ядер спермия в такие экстракты формируются митотические веретена. Такие экстракты являются популярной моделью для изучения процессов сборки веретена деления и формирования кинетохора i ii, . Добавление Са2 к таким ЦСФэкстрактам имитирует оплодотворение и вызывает переход в интерфазу.