Характеристика транскрипционной и белок-связывающей активности промотора ретротранспозона LINE1 крысы

• Автор: Федоров, Антон Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2006
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 115 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

Цели и задачи исследования

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. История открытия семейства повторов I1

2. Структура повторов I1

3. Консенсусные последовательности элементов II разных видов

4. Зарегистрированные ретротранспозиции I1

5. Предполагаемые механизмы ретротранспозиции элементов II

6. Воздействие элементов 11 на геном млекопитающих
7. Промоторные последовательности I1
8. Тканеспецифичность экспрессии I1
9. Белки, связывающиеся с видоспецифичными промоторами элементов
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
1. Выделение ядер и получение ядерного экстракта
2. ДНК, плазмиды и олигонуклеотиды
3. Метод торможения в геле ретардация
4. Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле
5. Инкубация белков, иммобилизованных на мембране с меченой ДНК Саузвестернблоттинг
6. Иммуноблоттинг
7. Ионообменная хроматография белков
8. Аффинная очистка белков
9. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание
. Флуоресцентная гибридизация i i I
. Выделение ДНК. Гибридизация по Саузерну и дотблот гибридизация
. Выделение РНК. Электрофорез РНК в формальдегидном агарозном
геле. Нозернблоттннг.
. Иммунопреципитация
. Иммунопрецепитация хроматина
. Компьютерные методы исследования
РЕЗУЛЬТАТЫ
1. Тканеспецифичность экспрессии 1 крысы.
2. Геномная организация I. Анализ промоторной области I.
3. Выявление белков, связывающих промотор элементов 1 крысы
i vi.
4. Определение молекулярной массы и связывающих
белков. Аффинная очистка этих белков.
5. Идентификация и связывающих белков.
6. Определение предполагаемых точек инициации транскрипции I
7. Состояние метилирования геномных промоторов I и влияние метилирования промотора I на связывание с белками , 3 и
МеСР2. .
8. Изучение связывания белков , 3, МеСР2 с промоторами I
i viv.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Существование таких последовательностей в геноме обнаружили, изучая кинетику реассоциации двунитевых дуплексов ДНК скорость ренатурации повторов существенно превосходила скорость ренатурацин уникальных последовательностей ДНК i, ii, . С помощью рестрикционного анализа удалось охарактеризовать несколько семейств повторяющихся последовательностей ДНК. Представители каждого из семейств содержали в своем составе определенные сайты рестрикции, и поэтому при обработке геномной ДНК соответствующей рестриктазой на фоне набора продуктов рестрикции, образовавшихся из уникальных последовательностей, выявлялись характерные фрагменты ДНК, соответствующие одному из семейств повторов. Первоначально такие семейства повторов называли по имени той рестриктазы, с помощью которой они были выявлены. Таким способом, например, были выделены семейства повторов у приматов , i , и I или МПМ у грызунов , v, iiv , , которые имели длину более 5 т. Рестрикционный анализ этих последовательностей не выявил характерную для тандемных повторов лестницу продуктов рестрикции таким образом был сделан вывод о том, что повторы и I диспергированы в геноме. Основываясь на структурных сходствах этих семейств повторов, они были отнесены к одному типу диспергированных повторяющихся последовательностей, названных I i i, . С помощью анализа первичных последовательностей было установлено, что повторы человека и мыши I гомологичны i , и, следовательно, являются представителями одного семейства, которое было названо I1 или I Viv , , . Секвенирование повторов 1 человека , , мыши , и крысы , i , позволило определить консенсусные последовательности элементов 1 этих видов, в которых в каждой позиции были представлены нуклеотиды, встречающиеся чаще всего. Схема 1. Элементы 1 имеют длину примерно 7 т. В составе повторов 1 выявлены 5 и Знетранслируемые районы 5 и 3, i, две открытые рамки считывания I и II i и область, богатая гуанинами. Анализ 5нетранслируемых районов ретротранспозонов 1 позволил выявить удивительную черту их организации оказалось, что в отличие от областей, кодирующих белки, 5нетранслируемые районы элементов 1 разных видов, в частности, человека, мыши и крысы являются абсолютно не гомологичными, и не обладают общим эволюционным происхождением , , , . Кроме этого, различных семейств элементов I приматов и грызунов структурная организация 5 отличается , , . В геноме большинство элементов 1 фланкированы короткими прямыми повторами длиной 7 п. Наличие таких повторов указывает на способность элементов 1 к перемещению, т. Поскольку на одном из концов консенсусной последовательности 1 присутствует участок, содержащий несколько аденинов полиА участок, которому предшествует сигнал полиаденилирования ААТААА, то можно было предположить, что новые ДНК копии элементов 1 синтезируются на полиаденштнрованной матрице РНК 1 с помощью процесса обратной транскрипции и затем встраиваются в геном. Дальнейшие исследования подтвердили это предположение. Следовательно, элементы 1 могут быть отнесены к классу ретротранспозонов. Кроме этого, было показано, что белки, кодируемые элементами 1, участвуют в основных этапах их ретротранспозиции, поэтому элементы 1 являются автономными ретротранспозонами i , , , . Автономные ретротранспозоны млекопитающих могут быть разделены на два типа ретротранспозоны, содержащие длинные концевые повторы , i , и ретротранспозоны, не содержащие . Длинные концевые повторы контролируют транскрипцию ретротранспозонов. К этому классу ретротранспозонов относятся, например, повторы I i, , и эндогенные ретровирусы i , . Повторы I не содержат длинных концевых повторов и относятся к классу ретротранспозонов, не обладающих .