Взаимодействие ядерного актина и NAP57/дискерина с белками, специфически связывающими сателлитную ДНК

• Автор: Кукалев, Александр Сергеевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 93 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

1. ВВЕДЕНИЕ

1.1. Цели и задачи исследования

1.2. Основные положения, выносимые на защиту.

2. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

2.1 Организация генома эукариот

2.2. Особенности организации сателлитных ДНК.

2.3. Белки, специфически связывающие сатДНК.

2.4. Гетерохроматин.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ а

3.1 Биохимические методы
3.1.1. Получение препарата ядерного матрикса
3.1.2. Получение ядерного экстракта из клеток культуры НеЬа.
3.1.3. Аффинная очистка актинсвязывающих белков на ДНКазе I
3.1.4. Аффинная очистка ядерного актина.
3.1.5. Получение и использование радиоактивно меченных фрагментов аминокислотной последовательности белка ЗАРАИпЯЫР Ц
3.1.6. Изучение степени аффиности пептидов к ядерному актину.
3.1.7. ЯйЗэлектрофорез и окрашивание гелей.
3.2 Молекулярные методы.
3.2.1. Плазмиды.
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК, электрофорез ДНК.
3.2.3. Полимеразная цепная реакция ПЦР
3.2.4. Праймеры.
3.2.5. Клонирование фрагментов ДНК
3.3. Иммунологические методы
3.3.1. Антитела.
3.3.2. Получение поликлональных антител.
3.3.3. Иммунопреципитация..
3.3.4. Иммуноблотинг
3.4. Цитологические методы
3.4.1. Культивирование клеток
3.4.2. Использование диотиобиссукциншшдилпропионата.
3.4.3. Трансфекция клеток культуры.
3.4.4. Синхронизация клеток
3.4.5. Иммунофлуоресценция.
3.4.6. Микроинъекции.
3.4.7. Выявление сайтов транскрипции.
3.5. Методы компьютерного анализа
РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1 Получение и тестирование поликлональных антител против белка I.
4.2. Локализация белков 0 и i.
4.3. Внутриядерная локализация белка i
4.4. Локализация белка и РНКгеликазы р семейства
4.5. Доменный анализ первичной последовательности белка
4.6. Изучение функциональной активности и характера локализации отдельных доменов белка , меченных
4.7. Белок взаимодействует с ядерным лктином i vi и i viv .
4.8. Локализация белка и ядерного актина в интерфазных и митотических клетках.
4.9. Белок взаимодействует с рлктином в ядре через Сконцевой домен белка
4 Белок взаимодействует с рлктином в ядре через
пяти аминокислотную последовательность НА СКОНЦЕ
4 Комплекс с рлктином необходим для транскрипции РНКПОЛИМЕРАЗОЙII
5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Аффинная очистка ядерного актина. Изучение степени аффиности пептидов к ядерному актину. ЯйЗэлектрофорез и окрашивание гелей. Молекулярные методы. Плазмиды. Выделение плазмидной ДНК, электрофорез ДНК. Праймеры. Антитела. Получение поликлональных антител. Иммунопреципитация. Использование диотиобиссукциншшдилпропионата. Трансфекция клеток культуры. Иммунофлуоресценция. Микроинъекции. Выявление сайтов транскрипции. Получение и тестирование поликлональных антител против белка I. Локализация белков 0 и i. Белок взаимодействует с ядерным лктином i vi и i viv . Локализация белка и ядерного актина в интерфазных и митотических клетках. ВЫВОДЫ. ПААТ полиакриламидный гель п. РНП рибонуклеопротеин сатДНК сателлитная ДНК асатДНК альфоидная сателлитная ДНК т. домены ii внутриядерные хранилища факторов сплайсинга. У высших эукариот последовательности сатДНК концентрируются в центромерных и тсломерных районах хромосом, однако их функциональная роль в процессе реализации генетической информации до сих пор не ясна. Достоверно известно, что сатДНК, образующие центромеру, обеспечивают формирование кинстохора, корректное спаривание и разделение хромосом в ходе митотического и мейотического делений клетки. Прицентромерные блоки сатДНК необходимы для правильной ассоциации сестринских хроматид. В интерфазный период сатДНК участвует в трехмерной организации интерфазного ядра i . ii, , определяющую транскрипционный паттерн клетки. Известно, что харакгер распределения центромер в ядре меняется в ходе клеточного цикла , , и эмбрионального развития . Изменение положения центромер в ядрах нейронов происходит при изменении транскрипционной активности при росте аксонов в условиях i vi , i, . Хорошо известна способность центромерного гетерохроматина ингибировать транскрипционную активность генов, при ассоциации последних с районами гетсрохроматииа. С другой стороны, ингибирование РНКполимеразы II приводит к декондснсацни прицептромерного гетерохроматина , , . Недавние исследования показали прямую связь между формированием гетерохроматина и посттранскрипционной регуляцией генной активности посредством механизма i i . РНК. Активность сатДНК должна определяться белковыми факторами, способными специфически распознавать последовательности сатДНК в ядре интерфазной клетки. Известные сатДНКсвязывающие белки определены с помощью сыворотки аутоиммунных больных i . , i, , либо методом ретардации в геле v . ДНКбелкового комплекса в ПАЛГ. Последний метод наиболее эффективен, поскольку позволяет точно определить специфичность распознавания использованных в качестве зонда последовательностей ДНК. Так с помощью метода ретардации в геле был установлен специфический характер взаимодействия РНКгеликазы р семейства с последовательностями альфоидной ДНК асатДНК человека и минорного сателлита миСат мыши . vi . с мажорным сателлитом мыши маСат v , . Предметом настоящего исследования стало изучение белковых комплексов, в состав которых входят РНКгеликаза р и белок . Целью настоящей работы являлось изучение взаимодействия ассоциированных с сателлитными ДНК белков и РНКгеликазы р с нехроматиновыми белками ядерным рактином и белком i. Получить а1ггитела, специфически узнающие белок . Определить функции изучаемых белковых комплексов. РНКгеликаза р семейства специфически взаимодействует с белком i i vi и колокализуется с ним во внутриядерных хранилищах факторов сплайсинга доменах. Комплекс белка с рактином взаимодействует с РНКполимеразой II в ядре и необходим для эффективной транскрипции. Белки, ассоциированные с последовательностями сателлитной ДНК, активно вовлечены в процессы метаболизма молекул РНК.