Исследование роли Src-киназы и фосфатидилинозитол-3-киназы в эндоцитозе рецепторов эпидермального фактора роста

• Автор: Железнова, Надежда Николаевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 126 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

ОГЛАВЛЕНИЕ .

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

2.1.Эпидермальный фактор роста и его рецептор.

2.2. Рецепторопосредованный эндоцитоз

2.2.1. Белки, регулирущие эндоцитоз.

2.2.2. Внутриклеточная компартментализация ЭФРрецепторных комплексов

2.2.3.Теории биогенеза эндосом

2.3. Рецепторы семейства ЕгЬВ и их лиганды.

2.4. Сигнальные пути, стимулируемые ЭФР.
2.5. Взаимосвязь между эндоцитозом и передачей сигнала .
2.6. Киназы Эгссемейства.
2.6.1. Структурные домены киназ Бгссемейства
2.6.2. Активация киназ Эгссемейства.
2.7. ФосфатидилинозитолЗкиназы.
2.7.1. Ингибиторы ФИЗкиназ
2.7.2. Роль ФИЗК в регуляции рецептор
опосредованного эндоцитоза
2.7.2.1. Роль ФИЗкиназ в регуляции функций
ранних эндосом.
2.7.2.2. Роль ФИЗкиназ в образовании мультивезикулярных тел
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Клеточные линии
3.2.Обработка клеток ингибиторами.
3.3. Получение йодированного ЭФР
3.4. Эксперименты по стимуляции эндоцитоза.
3.5. Анализ рециклирования
3.6. Субклеточное фракционирование в градиенте
плотности Перколла
3.7. Константы эндоцитоза.
3.8. Иммунофлуоресцентное окрашивание клеток.
3.9. Получение мембранной и цитоплазматической фракций
3 Электрофоретическое разделение белков.
3 Иммуноблоттинг
3 Антитела
4. РЕЗУЛЬТАТЫ.
4.1. Исследование роли киназы в регуляции эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов
4.1.1. Анализ динамики интернализации ЭФРрецепторных комплексов в клетках с нокаутом гена .
4.1.2. Анализ участия киназы в регуляции
деградации ЭФР
4.1.3. Анализ динамики рециклирования ЭФРрецепторных комплексов в клетках и
4.1.4. Исследование влияния ингибитора киназ семейства 5 на эндоцитоз ЭФРрецепторных
комплексов в клетках и НС
4.1.5. Иммунофлуоресцентный анализ распределения ЭФРрецепторных комплексов при действии 5 .
4.1.6. Исследование распределения клатрина после стимуляции эндоцитоза ЭФР в клетках А1, и
4.2. Исследование роли фосфатидилинозитол3киназы в эндоцитозе ЭФРрецепторных комплексов.
4.2.1. Анализ влияния вортманнина на динамику компартментализации рецептора ЭФР в клетках А1
4.2.2. Сравнение эффекта вортманнина при низких 1 нгмл
и высоких 0 нгмл концентрациях ЭФР
4.2.3. Исследование эндоцитоза ЭФРрецепторных комплексов при действии вортманнина с помощью метода
иммунофлуоресценции.
5. ОБСУЖДЕНИЕ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В ряде работ было показано, что ТКзависимая сортировка является насыщаемой при относительно низких 1 нМ концентрациях интернализованного ЭФР, при которых связывание с поверхностными рецепторами еще далеко от насыщения Вдовина и др. . Однако и при высоких концентрациях ЭФР, т. ТКзависимого пути. Этот, так называемый ТКнезависимый путь, по ряду характеристик схож с процессом эндоцитоза жидкофазных маркеров и лигандов рецепторов, не имеющих ТК активности таких, как липопротеины низкой плотности ЛИП, асиалогликопротеины, однако он происходит с эффективностью на порядок ниже Вдовина и др. Конкретные механизмы обоих типов сортировки к настоящему моменту неизвестны, но можно предполагать, что в последнем случае переход в поздние эндосомы осуществляется только с помощью универсальной системы белковрегуляторов везикулярного транспорта, без вовлечения рецепторспецифических сортирующих белков. ТК рецептора, вовлеченные в регуляцию сортировки. Зависимость эффективности интернализации и сортировки рецептора от активности его ТК указывает на то, что белкирегуляторы этих стадий являются ее субстратами. Сейчас известен целый ряд таких субстратов. Это адапторные белки , 2, транскрипционные факторы семейства , фосфолипаза Су ФЛСу, фосфатидилинозитол3киназа ФИЗК и киназа, а также ряд других белков , , . Представляется весьма интересным исследовать возможность участия в регуляции эндоцитоза известных сигнальных белков, активируемых рецептором ЭФР, тем более что имеются данные о вовлечении некоторых из них в регуляцию различных транспортных путей. Например, показано, что дрожжевой белок V, обладающий ФИЗкиназной активностью, регулирует транспорт между поздними эндосомами и вакуолью . Существуют исследования, посвященные роли ФИЗК в регуляции эндоцитоза рецепторов ростовых факторов, однако они малочисленны и исчерпываются двумя работами о влиянии вортманнина ингибитора ФИЗК на эндоцитоз рецепторов фактора роста, выделяемого тромбоцитами ФРВТ . . Однако в литературе нет данных о роли ФИЗК в регуляции эндоцитоза рецептора ЭФР. В последние годы появились также работы, в которых показано, что киназа, активирующаяся ЭФРзависимым образом, может участвовать в регуляции интернализации рецептора . Существуют данные о том, что активированная киназа способна фосфорилировать цитоплазматический клатрин белок, который входит в состав окаймления ямок и везикул, через которые в основном происходит поступление ряда высокомолекулярных веществ в клетку и вызывать его перемещение к ПМ i . ОЯ и ускоряя интернализацию рецептора ЭФР. ОЯ и превращения ее в окаймленную везикулу . Однако, вопервых, упомянутые работы содержат целый ряд внутренних противоречий, вовторых, совершенно не исследован вопрос о возможном влиянии на другие стадии эндоцитоза. Таким образом, вопрос о роли ФИЗкиназы и киназы в эндоцитозе рецептора ЭФР остается нерешенным. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Эпидермальный фактор роста и его рецептор. Ростовые факторы группа полипептидов, основная биологическая роль которых сводится к специфическому стимулированию синтеза ДНК и пролиферации клеток. Сигнальная сеть, которую образуют рецепторы ЭФРсемейства, регулирует пролиферацию и дифференцировку множества типов тканей. Нарушения регуляции этой сети являются причиной возникновения и прогрессии многих онкозаболеваний , , . Существует по крайней мере 8 различных гормонов, принадлежащих к семейству ЭФР сам ЭФР, , , амфирегулин, эпирегулин, бетацелулин, неорегулины, глиальный фактор роста i, , . Большинство белков этого семейства синтезируются как трансмембранные предшественники, которые могут образовывать растворимую форму гормона после протеолиза или функционировать в мембране. Растворимые гормоны могут состоять всего из аминокислотных остатков АО и имеют общий домен. Особенностью этого домена является наличие 6 цистеинов, образующих 3 дисульфидных мостика, формируя, таким образом, вторичную структуру молекулы гормона.