Локализация Т-кадгерина в стенке кровеносных сосудов и его влияние на адгезию и морфологию сосудистых клеток

• Автор: Иванов, Данила Борисович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил

Введение.

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1. Структура и функции кадгерннов.

1.1. Структура классических кадгерннов.

1.2. Взаимодействия кадгерннов с цитоплазматическими белками

1.3. Мсжклеючные контакты, в состав которых входят кадгерины.

1.4. Регуляция активности кадгеринов.

1.5. Кадгерины и сигнализация.

1.6. Роль кадгеринов в морфогенезе

1.7. Кадгерины и онкогенез

2. Структура и функции ГФИбелков.

2.1. Строение и синтез ГФИякоря.
2.2. Локализация ГФИбелков на клеточной поверхности.
2.3. ГФИякорь и подвижность белков
2.4. ГФИбелки и сигнализация
2.5. ГФИбелки и транспорт молекул, ГФИякорь как механизм высвобождения белков с поверхности клеток
2.6. Роль ГФИбелков в развитии заболеваний
3. Ткадгсрин атипичный, ГФИзаякоренный представитель
семейства кадгерннов
Глава II. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
1. Материалы и методы.
1.1. Культивирование клеток
1.2. Выделение мембран культивируемых клеток.
1.3. Выделение клеточных мембран из тканей человека
1.4. Солюбилизация белков мембран культивируемых клеток и
тканей человека
1.5. Определение концентрации бедка
1.6. Электрофорез белков и нммуноблотинг.
1.7. Получение образцов аорты человека и их морфологическая характеристика.
1.8. Иммуногистохимнческое окрашивание срезов аорты человека.
1.9. Выделение суммарной РНК.
1 Очистка информационной РНК мРНК
1 Синтез комплементарной ДНК кДНК
1роведснис полимеразной цепной реакции ПЦР.
1 Схема клонирования и субклонирования полноразмерной кДНК Ткадгерина, фрагмента люцнферазы и фрагментов кДНК Ткадгерина, соответствующих отдельным доменам.
1 Клонирование ПЦРнродуктов.
1 Получение компетентных клеток .i.
1 Трансформация компетентных клеток и селекция колоний.
1 Выделение плазмиды из . i
1 Секвенированис.
1 Нозсрнблоттинг
1 Трансфекция эукариотических клеток и селекция клонов.
1 Экспрессия рекомбинантных доменов кадгерина в i.
1 Очистка рекомбинантных доменов Ткадгерина на i агарозе.
1 Получение поликлональных антител против рекомбинантных
доменов Ткадгерина.
1 Приготовление им.муноаффииного сорбента для получения аффинноочищенных поликлональных антител против Ткадгерина
1 Связывание антител против Ткадгерина с поверхностью клеток
1 Измерение Са2зависимой агрегации клеток
1 Изучение влияния антител к доменам Ткадгерина на культивируемые
клетки сосудов человека.
1 Цитохимическое окрашивание актнновых филачентов в культивируемых клетках
1 Изучение экспрессии Ткадгерина в митозе и при алоптозе
1 Материаты
2. Результаты исследования.
2.1. Получение поликлонатьных антител против рекомбинантных
фрагментов человеческого Ткадгерина.
2.1.1. Синтез полноразмерной кДНК Ткадгернна.
2.1.2. Получение кроличьих антисывороток и аффинно очищенных
кроличьих поликлональных антител против рекомбинантных
доменов Ткадгерина
2.2. Изучение экспрессии Ткадгерина в сосудистой системе
2.2.1. Распределение и экспрессия Ткадгерина в органах и
тканях человека
2.2.2. Экспрессия Ткадгерина в стенке аорты
2.2.3. Экспрессия Ткадгерина в атеросклеротических поражениях
2.3 Влияние экспрессии Ткадгерина на межклеточную адгезию и
морфологию трансфектных клеток.
2.3.1 Трансфекция клеток линии Ь9 полноразмерной кДНК Ткадгерина. селекция клонов и их тестирование .
2.3.2. Влияние экспрессии Ткадгерина на межклеточную агрегацию и морфологию трансфектных клеток
2.4 Влияние антител против различных доменов Ткадгерина на адгезию и морфологию культивируемых клеток сосудов человека.
2.4.1 Влияние антител против Ткадгерина на адгезию
клеток к субстрат.
2.4.2 Влияние антител против Ткадгерина на морфологию эндотелиальных клеток.
2.4.3. Влияние антител против Ткадгерина на перестройку
цитоскслста в эндотелиальных клетках
2.5 Экспрессия Ткадгерина в клеточном цикле.
2.6 Экспрессия Ткадгсрина при апогттозс.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ
Список литературы


Изучить распределение и локализацию Ткадгерина в органах и тканях человека, в том числе в сосудистой системе в норме и при развитии атеросклероза. Получить специфические антитела к Ткадгсрину и изучить их влияние на адгезию и морфологию гладкомышечных и эндотелиальных клеток сосудов. Получить стабильно трансфсцированныс клеточные линии, экспрессирующие Ткадгерин, и изучить влияние этого белка на адгезию и морфологию трансфекгантов. Исследовать экспрессию Ткадгсрина в глалкомышечных и эндотелиальных клетках сосудов на этапах пролиферации и аноятоза этих клеток. В представленной работе впервые проведен анализ экспрессии Ткадгсрина в органах и тканях человека и подробное гистохимическое исследование его распределения в стенке аорты человека в норме и при атеросклерозе. Кроме того показано, что Ткаагерин способен опосредовать слабую межклеточную Сазавнсимую адгезию. Ткадгсрин также может влиять на клеточную морфологию и способность клеток к адгезии, чго было выявлено в опытах с использованием специфических антител к этому белку. Впервые показано изменение экспрессии Ткадгерина в митозе и при апоптозе гладкомышечных н эндотелиальных клеток стенки сосудов. Результаты работы представлены на научных конференциях XI Ii V i i, v i i i i, i Ii i ii ii i , Пущино, . В заключении можно сказать, что полученные в процессе работы результаты позволяют сделать вывод о том, чго Ткадгерин играет важную роль в сосудистой стенке, участвуя в регуляции адгезии клеток, клеточного фенотипа и клеточной подвижности. Экспрессия Ткадгсрина в клетках сосудов зависит от их функционального состояния и коррелирует с развитием патологических изменений стенки аорты при атеросклерозе. Представленные данные являются новым этапом в изучении роли Ткадгерина как в сосудистой системе, так и в организме в целом. Глава. СТРУКТУРА И ФУНКЦИИ КАДГЕРИНОВ. Структура классических кадгеринов. Большинство членов суперссмсйства кадгеринов это трансмембранные гликопротсиды, пронизывающие плазматическую мембрану один раз, при этом терминальный конец белковой цепи расположен снаружи, а Сконеи внутри клетки рис. А. Внеклеточная часть молекулы кадгерина состоит из вариабельного числа так называемых кадгериновых доменов, высокогомологичных друг другу каждый из доменов состоит приблизительно из 0 аминокислотных остатков ii, . Классические кадгерины содержат по пять кадгериновых доменов, которые принято обозначать ЕС , начиная нумерацию с конца молекулы. Конформация молекулы кадгерина стабильна только в присутствии ионов Са2 связывание которых с внеклеточной частью полипептидной цепи является необходимым условием для обеспечения кадгеринзависимой межклеточной адгезии. Кальцийсвязываюшие участки, в состав которых входят короткие высококонссрвативныс аминокислотные последовательности, расположены между внеклеточными повторами . Цитоплазматический домен классических кадгеринов ассоциирован с цитоплазматическими белками катснинами, которые, в свою очередь, служат промежуточным связующим звеном между кадгеринами и акгиновы. Именно этот кадгеринкатениновый комплекс необходим для обеспечения полноценной межклеточной адгезии. Внеклеточные домены кадгеринов сами по себе способны к гомофильному узнаванию и связыванию в ряде экспериментов показано, что клетки, экспрессирующие мутантные кадгерины без цитоплазматического домена, были способны связываться с субстратом, покрытым очищенными кадгериновыми э кто доменам и, однако эта адгезия была намного слабее, чем в случае клеток, несущих полноразмерные кадгерины i ii, . Эти данные свидетельствуют о том, что установление стабильных межклеточных контактов зависит от наличия в молекуле кадгерина функционально активного цитоплазматического домена и его ассоциации с цитоскелетом. Рис. Строение кадгерннов н типы образуемых ими межклеточных контактов , . А Строение классических кадгеринов и их взаимодействие с цитоплазматическими белками. Ь Две модели молекулярной организации кад1еринов в адгезивных контактах модель молекулярная молния, предложенная на основании данных рентгеноструктурного анализа доменов ЕС1 Ыкадгсрина. В Типы межклеточных контактов, формируемые кадгеринами в различных тканях.