Реакция остеогенных клеток на механическое воздействие и специфичность их рецепторов к компонентам внеклеточного матрикса

• Автор: Садофьев, Леонид Аполлонович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 77 с.

Содержание
ВВЕДЕНИИ.

Основные положения, выносимые на защиту

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

Особенности костной ткани и остеогенез.

Гормональная регуляция дифференцировки остеогенных клеток в культуре.

Результаты механических воздействий на культивируемые остеогенные клетки

Взаимодействие культивируемых остеогенных клеток с внеклеточным матриксом.

Формирование и передача сигнала от ВКМ и механического сигнала.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Клеточные культуры.

Механическое воздействие на клетки.
Исследование внутриклеточной подвижности с помощью сканирующего акустического микроскопа
Окрашивание клеток на Фактин
Определение активности щелочной фосфатазы
Выделение и очистка коллагенов.
а. Экстракция коллагенов из кожи крыс
б. Экстракция коллагенов из плаценты человека
в. Разделение коллагенов дробным солевым осаждением
г Хроматография на ДЭАЭцеллюлозе
д. Гельхроматография на сефакриле 0 .
е. Лиофилизация и хранение.
Приттовление колонок для аффинной хроматофафии.
Выделение белков плазматической мембраны клеток
Препаративное выделение рецепторов.
Определение специфичности рецепторов по отношению к тину коллагена.
Определение аффинности рецепторов к коллагенам разных типов
Получение антител
Иммуноблотгинг.
Аффинная хроматография на иммобилизованных антителах против белка 0 КДа
Иммунофлюоресцснтнос окрашивание клеток
Компьютерные методы
РЕЗУЛЬТАТЫ
Реакция клеток на механическое воздейегвие.
Форма клеток и Факгин.
Содержание Фактина в клетках линии
Изменение подвижности участков клетки
Исследование длительного ответа остеогенных клеток на механическое воздействие
в культуре.
Анализ специфичности рецепторов по отношению к типу коллагена
Коллагены высокой степени чистоты
Специфичность рецепторов по отношению к типу коллагена
Зависимость специфичности от условий хроматографии.
Идентификация коллагенсвязывающих рецепторов
Получение и тестирование антител
Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток.
Идентификация на основе иммуноблоттинга.
Аффинная хроматография на антителах А0
ОБСУЖДЕНИИ
БЛАГОДАРНОСТИ.
ЛИТЕРАТУРА


Гормональная регуляция дифференцировки остеогенных клеток в культуре. Взаимодействие культивируемых остеогенных клеток с внеклеточным матриксом. Формирование и передача сигнала от ВКМ и механического сигнала. Клеточные культуры. Механическое воздействие на клетки. Выделение и очистка коллагенов. Гельхроматография на сефакриле 0 . Лиофилизация и хранение. Приттовление колонок для аффинной хроматофафии. Препаративное выделение рецепторов. Определение специфичности рецепторов по отношению к тину коллагена. Иммуноблотгинг. Реакция клеток на механическое воздейегвие. Форма клеток и Факгин. Зависимость специфичности от условий хроматографии. Иммунофлюоресцентное окрашивание клеток. Идентификация на основе иммуноблоттинга. БЛАГОДАРНОСТИ. Микроокружение клетки играет ключевую роль в регуляции ее поведения, в том числе в переключении состояний пролиферациядифференцировка. Особую роль играет взаимодействие клеточных рецепторов с белками внеклеточного матрикса ВКМ. Взаимодействие этих рецепторов со своими лигандами может приводить как к формированию сигнала химической природы например каскады фосфорплирования гак и к изменению формы клетки и перераспределению баланса механических сил I , . Механическое воздействие на клетку в свою очередь неизбежно изменяет характеристики связывания рецепторов с белками ВКМ. Таким образом, рецепторы к белкам ВКМ являются и сигнальными рецепторами и механорецепторами. Эта двоякая роль рецепторов непосредственно связана с процессом формирования . v , , тивной регенерацией и функционированием тканей взрослого организма i , . ВКМ, предполагает участие клеточных структур, в частности структурную перестройку компонентов цитоскелета. Исследование процессов адаптации клетки к механическим воздействиям структурных перестроек клеточных компонентов, включая изменение формы клетки и структуры цитоскелета. Исследование долговременных клеточных реакций, в первую очередь затрагивающих вызванные адаптационными перестройками изменения функционирования клеточного генома. Исследование механизмов формирования сигнала, вызывающег о кратковременные и долговременные изменения функционирования клетки. Имеются многочисленные данные, показывающие, что при внешних формообразующих воздействиях на клетку, как чисто механических, так и механохимических, вызванных изменением состава ВКМ, наблюдаются значительные адаптационные перестройки внутриклеточных структур, в частности цитоскелета I , . К сожалению, большинство применяемых методов исследования, позволяющих отслеживать структурные изменения отдельных клеточных элемен тов, не обладают временным разрешением, достаточным для выявления изменений, происходящих в течение первых минут после воздействия. Большинство этих методов являются разрушающими и, следовательно, они не дают возможности отслеживать изменения, происходящие в одной и гой же клетке. До сих пор не удалось однозначно связать долговременную несколько суток реакцию клеток на механическое или механохимическое воздействие с наблюдавшимися адаптационными перестройками. По литературным данным, механическое воздействие на клетки обладает длительным постэффектом. Воздействие сказывается на таких параметрах, как изменение уровня транскрипции некоторых генов, изменение уровня активности ряда ферментов, и ряде других, свидетельствующих о значительных изменениях функционального состояния клетки Садофьсв, Подгорная, . Однако данные, полученные разными авторами противоречивы. Есть данные о том, что механическое воздействие на клет ки повышает степень их дифференцированности, определяемой по экспрессии генов тканеспецифичных белков , , , но по данным других авторов понижает, стимулируя одновременно клеточную пролиферацию , . Воздействие механической нагрузки на клетки опосредуется ВКМ ii , . Следовательно, целесообразно говорить о механохимических формообразующих воздействиях, определяющихся как внешними по отношению к клетке силами, так и взаимодействием клетки с ВКМ.