ЭФР-зависимая передача сигнала с участием транскрипционного фактора STAT

• Автор: Василенко, Константин Петрович
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 108 с. : ил.

К сожалению, не было проведено количественного сравнения ТК активности интернализованного рецептора ЗФР и рецептора на плазматической мембране, которое принципиально важно для понимания роли интернализации. Необходимо отметить, что процесс интернализации детально изучен на клетках А1, поэтому мы выбрали их в качестве объекта исследования. В последние годы начали появляться прямые доказательства участия интернализованных рецепторов в проведении сигнала. Была показана важность интернализации рецептора ЭФР для активации фосфатидилинозитол3киназы I3 и 1. Vii . X, , . Это демонстрирует актуальность и перспективность таких исследований для широкого спектра мишеней рецептора ЭФР. Складывается картина, согласно которой интернализация рецепторов факторов роста необходима для активации и контроля специфических сигнальных путей. Подобные исследования пока не проводились в отношении белков семейства i iv ii группы латентных цитоплазматических транскрипционных факторов, которые активируются рецепторами цитокинов и факторов роста, транспортируются в ядро и активируют транскрипцию ряда генов , . Причем фосфорилированная форма 1 обнаруживается в ядре уже через 2 мин после начала стимуляции клеток ЭФР. Транспорт в ядро 1 обеспечивается взаимодействием с кариоферином 1 i . Остается недостаточно изученным ряд вопросов, связанных с функционированием белков, и, в частности, 1. Так, остается неясной возможность активации 1 интернализованным рецептором ЭФР, механизм транспорта активированного 1 до ядерной поры, локализация взаимодействия 1 и кариоферинов, обеспечивающих транспорт белков в ядро, роль активированного 1 в цитоплазме и динамика инактивации 1 в ядре. Особый интерес представляет проблема участия цитоскелета клетки в процессе передачи сигнала. Общеизвестно, что рецепторопосредованный эндоцитоз зависит от системы микротрубочек. Установлено, что некоторые важные сигналпередающие белки, такие как МАРК, 2, , РКС связаны с цитоскелетными структурами . Картина существенно усложнилась после открытия семейства аз , и , которые не только регулируют перестройки цитоскелета, но и участвуют в активации I3 и МАР киназ , , . В последнее время также появились данные об участии цитоскелета в транспорте сигнальных молекул в ядро. Было показано, что транспорт в ядро протеинкиназы С и 1. Арнаутов, Никольский, . В связи со всем сказанным выше, в настоящей работе представлялось актуальным изучить ЭФРзависимую передачу сигнала через транскрипционный фактор 1 и участие в этом процессе интернализованного рецептора ЭФР. Методом фосфорилирования синтетического субстрата I vi нам удалось продемонстрировать, что в клетках А1 интернализованный рецептор ЭФР имеет такую же тирозинкиназную активность, как и рецептор, находящийся на плазматической мембране. Это свидетельствует о возможности проведения сигнала через интернализованный рецептор ЭФР. Используя метод субклеточного фракционирования мы изучили динамику ЭФРзависимого перераспределения 1 меаду ядерной и цитоплазматической фракциями клеток А1. А1. Удаление ЭФР после стимуляции клеток вызывает дефосфорилирование 1 в цитоплазме и ядре в интервале от мин до 1 часа и уменьшение содержания 1 в ядре до контрольного уровня. Мы исследовали возможность активации фактора 1 интернализованным рецептором ЭФР. Используя метод субклеточного фракционирования органелл в градиенте Перколла и коиммунопреципитацию нами впервые продемонстрировано ЭФРзависимое взаимодействие 1 и интернализованного рецептора, находящегося в составе ранних эндосом. Иммунофлуоресцентными и биохимическими методами была изучена зависимость транспорта 1 в ядро от целостности цитоскелета клетки. Нами впервые показано, что ЭФРиндуцированный транспорт активированного 1 в ядро тормозится при разрушении микротрубочек под действием нокодазола, но не зависит от системы микрофиламентов. При этом обработка нокодазолом не препятствует образованию комплекса между фосфорилированным 1 и кариоферином а, и наблюдается накопление этого комплекса в цитоплазме. На основании этого сделано предположение о том, что взаимодействие комплекса Iкариоферин а с цитоскелетом может быть существенным элементом функционирования механизма транспорта 1 из цитоплазмы в ядро.