Негистоновые белки хроматина HMG1, HMG2, HMG17 и линкерный гистон Н1-эффективные носители ДНК в процессе трансфекции

• Автор: Зайцев, Сергей Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 102 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.
1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. НЕВИРУСНЫЕ ТРАНСФЕКЦИОННЫЕ СИСТЕМЫ ИСТОРИЯ РАЗВИТИЯ, СОВРЕМЕННОЕ СОСТОЯНИЕ И ПЕРСПЕКТИВЫ ПРИМЕНИМОСТИ В ГЕННОЙ ТЕРАПИИ.

1.1. СИСТЕМЫ ДОСТАВКИ ГЕНОВ В КЛЕТКИ 1К УГЛЮ

1.1.1. Катьцийфосфатная копреципитация.

1.1.2. Физические методы доставки генов.

1.1.3. Катионные липиды и липосомы

1.1.4. Лигандопосредованная трансфекция

1.2. ТРАНСФЕКЦИЯ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ БЕЛКОВЫХ

НОСИТЕЛЕЙ.

1.2.1 Современные представления о первом уровне организации хроматина.

1.2.2. НМОбелки. История открытия, структура и
свойства
1.2.3. Линкериый гистон Н1 предполагаемый переносчик ДНК
в процессе трансфекции. Структура и свойства
1.3. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. МАТЕРИАЛЫ
2.1.1. Ткани
2.1.2. Белковые экстракты.
2.1.3. Клеточные линии и условия их культивации.
2.2. МЕТОДЫ
2.2.1. Ацетоновое фракционирование.
2.2.2. Хроматографическая очистка белков.
2.2.3. Полиакриламидный гельэлектрофорез
2.2.4. Идентификация белков
2.2.5. Ретардация в агарозных гелях
2.2.6. Постановка трансфекции i vi.
2.2.7. Иммуноцитохимическая визуализация
трансфекционных комплексов.
2.2.7.1. Меченисбелка
2.2.7.2. Мечение векторной ДНК.
2.2.7.3. Иммуномаркирование эндосомлизосом
2.2.7А Детекция трансфекционных комплексов.
2.2.7.5. Микроскопирование.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. История вопроса и постановка задачи
3.2. Ацетоновое фракционирование исходных ядсрных
эстракгов
3.3. Хроматографическое разделение компонентов ацетоновых
фракций
3.4. Ретардация в агарозных гелях. Вопрос нативности
12.
3.5. Роль Са2 при оптимизации условий постановки
трансфекции
3.6. Иммуноцитохимическая детекциятрансфекционных
комплексов. Роль Са2.
4. ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
5. ВЫВОДЫ.
6. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ8В
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Представленная работа относится к сравнительно недавно возникшей в этой области ветви исследований, связанной с использованием белков или же полипептидов в качестве компатизующих ДНК агентов, образующих комплексы с ДНК, проникающие в клетку в процессе трансфекции . . В качестве компактизующего и переносящего ДНК агента в нашей работе используются белки, так или иначе участвующие в упаковке и структуризации хроматина i viv. Подобный выбор сделан, исходя из следующих предпосылок. Вопервых, белки хроматина изначально обладают свойством компактизовать ДНК и тем самым могут не только способствовать проникновению чужеродной ДНК в клетку, но и защитить ее от внутриклеточных нуклеаз при транспорте в клетке. Вовторых, белки хроматина имеют в своем составе последовательность аминокислот, ответственную за ядерную локализацию ii i , что может способствовать направленному транспорту трансфецируемой ДНК в ядро. Направление это представляется многообещающим, поскольку использование белков хроматина в качестве носителей может позволить не только эффективно компактизовать и транспортировать чужеродную ДНК внутрь клетки, но и доставлять ее в ядро в форме приемлемой для активной транскрипции. Цели и задачи исследования. Цель предлагаемой работы состояла в том, чтобы установить, какие из ядерных белков, участвующих в структурной организации хроматина, могут служить эффективными белкаминосителями в процессе трансфекции ДНК в клетки млекопитающих. С выделенными активными в трансфекции белками предполагалось провести оптимизацию условий трансфекции и определихь механизмы к пути следования в клетке тоансфекнионных ДНКбелковых комплексов. В качестве источника белков хроматина использовали зобную железу тимус теленка объект, ставший классическим при изучении ядерных белков. Провести различными способами экстракцию белков из ядер клеток тимуса теленка, расфракциопировать гидрофобным растворителем полученные экстракты и оценить их потенциальную трансфекционную активность на системах с репортерным геном i vi. Применяя различные типы и способы хроматографической очистки, получить активные в трансфекции белки в чистом виде и идентифицировать их. Для каждого белка подобрать оптимальные условия для постановки трансфекции i vi и провести сравнение активности с уже имеющимися коммерческими аналогами в этой области. Полученные результаты попытаться применить для постановки трансфекции i viv. Применяя иммуномаркирование, изучить основные стадии процесса трансфекции, а именно захват ДНКбелковых комплексов клетками, пути внутриклеточного транспорта этих комплексов к ядру, внутриядерную локализацию комплексов. Научная новизна и научнопрактическая ценность работы. Результатом работы явилось обнаружение трансфекционной активности у четырех белков хроматина. Была доказана ранее предполагавшаяся способность быть носителями ДНК в процессе трансфекции для белков I и 2, принадлежащих к группе белков хроматина с высокой электрофоретической подвижностью i ii . Впервые была обнаружена трансфекционная активность у негистонового хроматинового белка iv . Наиболее важным стало открытие у линкерного гистона Н1 способности быть носителем ДНК при трансфекции iv . . Было установлено, что после оптимизации условий при постановке трансфекции i vi с использованием Н1 в качестве носителя ДНК, можно добиться уровня трансфекции равного и даже превышающего таковой эффект при использовании общеизвестных и коммерчески доступных трансфекционных агентов липофектин, липофектамин и т. iv . . Необходимо также отметить, что перед этими агентами Н1 имеет огромное преимущество в том, что комплексы образуемые им с переносимой ДНК не являются токсичными для клеток даже в ВЫСОКОЙ КОНЦСЕ1ТраЦИИ. Гистон I, в отличие от большинства липосомобразующих соединений, способен сохранять трансфскционные свойства в присутствии 0 сыворотки, что делает потенциально возможным его применение для трансфекции i viv. Нами было показано, что трансфекция с применением 12, , а также гистона Н1 является Са2зависнмым процессом iv . . .