Регуляция дифференцировки клеток трансгенными нейротрофическими факторами

• Автор: Павлова, Галина Валериевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 275 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. Межвидовая ксенотрансплантация.

1.2.Лечение нейродегенеративных заболеваний методом трансплантации.

1.3. Восстановительный потенциал центральной нервной системы и связанные с ним проблемы трансплантологии

1.3.1 .Формирование глиального рубца и его влияние на регенерацию

аксонов
1.3.2. Характеристика методов, направленных на улучшение восстановительных свойств ЦНС при повреждениях

1.4. Нейротрофические факторы НФ

1.4.1. Понятие и классификация нейротрофических факторов

1.4.2. Общая характеристика лигандов семейства ООМДОРЬб

1.4.3. Характеристика рецепторов лигандов семейства ОЭЬП7.
1.4.4. Индуцируемая СПЕЛ7 ВЕТзависимая передача сигнала внутрь
клетки.
1.4.5. Индуцируемая ОВЫБ КЕТнезависимая передача сигнала
внутрь клетки.
1.4.6. Взаимодействие сигнального пути, индуцируемого СОЫР, с сигнальными путями других факторов.
1.4.7. Экспрессия и физиологические функции СЭМ7.
1.4.8. Защитные и восстановительные свойства СЭМ
1.4.9. Общая характеристика лигандов семейства МвБ
1.4. Характеристика фактора роста нервов
1.4 Структура фактора роста нервов.
1.4. Рецепторы ЫвЕ V
1.4 Сигнальные каскады, запускаемые ЫвЕ.
1.4 ВОЕЛ7 как член семейства ЫвЕ
1.4 Внутриклеточные каскады, активируемые
1.4 Исследование мышей, нокаутированных по гену
1.4 Свойства , влияние на дифференцировку нейронов
1.4 Влияние нейротрофических факторов на поведение и память.
1.4 Нейротрофические факторы при нейродегенеративных заболеваниях 1.5. Белки теплового шока .
1.5.1. Классификация
1.5.2. Факторы индукции .
1.5.3. Регуляция экспрессии белков семейств .
1.5.4. Локализация и свойства .
1.5.5. .i.v.
1.5.6. Структурнофункционалный анализ белков семейства
1.5.7. и апоптоз
1.5.8. Стресс, адаптация и белки теплового шока
1.5.9. Перспективы использования системы в медицине
1.5 Экспрессия шаперонов в головном мозге
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Методы
2.1.1. Рестрикция плазмидиой ДНК.
2.1.2. Электрофорез в агарозном геле.
2.1.3. Выделение фрагментов ДНК из геля
2.1.4. Лигирование.
2.1.5.1 Григотовление компетентных клеток
2.1.6. Трансформация компетентных клеток плазмидами
2.1.7. Выделение плазмидной ДНК из Е. i в малом объеме
2.1.8. Выделение плазмидной ДНК из .i в большом объеме.
2.1.9.Контроль наличия вставки блотгибридизация по Саузерну.
2.1 Анализ ДИКпоследовательности.
2.1. .Конструкции.
2.1Метод инъекций.
2.1 Выведение линий.
2.1 Гибридизащш i i на целых эмбрионах
2.1 Очистка плазмид для введения в культуру клеток Млекопитающих
2.1 Введение плазмиды в клетки линии НЕК3 при помощи x 0 i .
2.1 Введение плазмиды в ЭСК мтлши линия 1 методом электропорации.
2.1 Выделение суммарного препарата РНК
2.1 Проведение электрофореза РНК
2.1 Нозернблот гибридизация
2.1 Электрофорез в ПААТ.
2.1 Вестернблот гибридизация.
2.1 Культивирование клеток линии НЕК3.
2.1 Получение мышиных эмбриональных фибробластов
2.1 Желатинизирование культуральных чашек.
2.1 Обработка МЭФ митомицином С.
2.1 Культивирование ЭСК мыши линии 1
2.1 Проведение трансплантации.
2.1 Получение срезов мозга
2.1 Иммуноцитохимический анализ.
2.1 Количественная оценка величины глиального рубца.
2.1 Кокультивация фрагмента зачатка спинного мозга эмбриона человека с клетками трансгенной линии НЕК3, экспрессирующей
2.1 Получение первичной культуры клеток., трансгенных по гену .
2.2.1. Реактивы.
2.2.2. Растворы, среды
2.2.3. Вектора
2.2.4. Праймера.
2.2.5. Антитела.
2.2.6. Линии клеток
3. РЕЗУЛЬТАТЫ.
3.1. Создание трансгенных линий i гомозиготных по
нейральному гену млекопитающих
3.2. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на трансгенные клетки
3.3. Влияние экспрессии нейротрофического фактора на окружающие клетки при кокультивации
3.4. Влияние нейроэктодермы трансгенных линий на окружающие клетки при ксенотрансплантации
3.5. Влияние белка теплового шока дрозофилы на образование рубца при трансплантациях
3.6. Использование промоторнорегуляторной пр области гена белка теплового шока дрозофилы , в качестве регуляторного элемента при введении чужеродных генов в клетки млекопитающих
3.7. Использование полученного вектора 1, содержащего пр область гена дрозофилы и маркерный ген , в культурах клеток и в целых организмах.
3.8. Получение конструкции для экспрессии в клетках млекопитающих
3.9. Изучение влияния гиперэкспрессии при кокультивации
3 Получение конструкции для экспрессии в клетках млекопитающих
3 Исследование влияния гиперпродукции белка на трансгенные клетки.
3 Изучение влияния гиперэкспрессии при кокультивации
3 Изучение влияния гиперэкспрессии на образования глиальной
ткани при трансплантациях.
4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Ниже будут рассмотрены эти методы и обсуждены их достоинства и недостатки. Супрессия синтеза белков астроцитов. При развитии астроглиозиса наблюдается увеличенй1Ькспрессии двух структурных белков астроцитов глиального кислого фибриллярного белка и виментина. Было предположено, что снижение концентрации этих белков приведет к уменьшению глиального рубца, образующегося при повреждениях в пределах центральной нервной системы. Была полученалиния трансгенных мышей, лишенная гена Однако трансгенные мыши демонстрировали нормальный глиальный ответ на повреждения центральной нервной системы. Кроме того, было показано, что аксоны не способны прорастать через поврежденную зону , , , . У трансгенньтх мышей, лишенных гена виментина ii 7а 1 также у мышей с двойным нокаутом отсутствуют гены и виментина, наблюдается нормальный реактивный глиоз в ответ на травму ЦНС. К сожалению, репаративные свойства нервной ткани в данных случаях изучены не были Реклу , . ЦНС, поскольку они не являются белками поверхности астроцитов, и не показано их влияние на синтез предполагаемого ингибитора регенерации ЦНС хондроитинсульфатного протеогликана. Удаление астроцитов из места повреждения. Было предположено, что удаление глиальных клеток из травмированного участка предотвратит формирование глиального рубца. Одним из методов воздействия на астроциты является введение аналога глутамата аминоадипата , который оказывает токсическое действие на эти клетки и в то же время не влияет на выживаемость нейронов , . Показано, что введение ААА способствует образованию вокруг очага поражения зош, свободной от астроцитов, которая сохраняется в течение семи дней. Другой метод воздействия на астроциты создание трансгенных мышей, несущих под промотором ген тимидин киназы герпеса , , , . При реактивном глиозе в ответ на повреждение происходила активация этого промотора, что приводило к синтезу тимидин киназы. В очаг а повреждения вводили ганцикловир, который под воздействием синтезируемого фермента превращался в цитотоксическое вещество, убивающее астроциты. При использовании этой модели было показано, что в очаге повреждения повышается число нсйрофиламентМ позитивных аксонов по сравнению с диким типом. Можно заключить, что микроокружение, возникающее при удалении астроцитов из травмированной области, способствует прорастанию аксонов. Однако следует отметить, что в поврежденной области, свободной от астроцитов, не было обнаружено тел нейронов. Кроме того, у трансгенных мышей не происходило восстановление гематоэицефалического барьера в месте травмы, в то время как у животных дикого типа он восстанавливался в течение дней , . Использование факторов, ингибирующих астпоглиозис. Одним из факторов, влияющих на астроглиоз, является . ЦНС, в том числе в клеточной пролиферации и дифференцировке. Имеются данные, что при нейротравме экспрессия и его рецепторов колокализуется с микроглией в очаге поражения i , . Введение в поврежденный кортекс вызывает сильный астроглиоз, сопровождающийся экспрессией фибронектина, ламинина и . При использовании антител к синтез этих белков снижался , . Однако снижение уровня функционально активного может привести к нежелательным последствиям, поскольку он является фактором выживания мотонейронов. I при введении в кортекс супрессирует ответ макрофагов и микроглии на травму, снижает реактивный глиоз i , . Влияние на белки внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом. Существует несколько способов влияния на белки внеклеточного матрикса. Один из них прерывание синтеза этих белков. В экспериментах i vi было продемонстрировано, что использование ксилозида ингибитор синтеза протеогликанов эффективно снижает синтез i , . Однако использование этого ингибитора синтеза протеогликанов опасно изза проявляющегося в большинстве случаев токсического эффекта. В состав внеклеточного матрикса, ассоциированного с глиальным рубцом, входит коллаген типа IV. Известно, что 2,2 дипиридин препятствует формированию тройной спирали коллагена. Были проведены работы, в которыхi н очаг, поражения нервной ткани вводили i , , i , .