Иммуноцитохимическое исследование белков, ассоциированных с ядерной оболочкой, в интерфазе и митозе

• Автор: Курчашова, Светлана Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 175 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

ЦЕЛИ И ЗАДАЧИ РАБОТЫ

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

1. Выделение ядер

2. Выделение комплекса ядерных оболочек с периферическим хроматином

3. Получение хроматина, не связанною с ядерной оболочкой

4. Получение кислоторастворимых белков

5. Подютовка проб к электрофорезу

6. Определение белка

7. Электрофорез белков
8. Элсктроперснос
9. Получение и очистка антител
. Иммуноблоттинг
. Культура клеток
. Получение микроядер и почек
. Иммуноцкгохимическое выявление белков, участвующих в формировании ядерной оболочки
. Иммуноцктохимическое выявление бромдезоксиуридима
. Получение хромосомных препаратов
. Электронная микроскопия
РЕЗУЛЬТАТЫ
. Динамика белков, участвующих сборке ядерной обаючки. в ямщочном иикче.
1. Иммунолокализация ламинов АС в клеточном цикле
2. Иммунолокализация ламинов В в клеточном цикле
3. Иммунолокализация .АР2 в клеточном цикле
Ламины АС
Ламины В
оболочки, с хромосомами в условиях пространственного разобщения хромосом. Ламины АС
Ламины В
4. Локализация белков, участвующих в микроядроми.
5. Особенности организации ядепной оболочки в клетках с почками.
1. Ультрасфуктурный анализ клеток с почками
2. Особенности организации ламины в клетках с почками
3. Индукция образования ночек происходит в клетках, находящихся в в фазе клеточного никла.
1. Выделение и улътраструктурный анализ фракции ядерных оболочек анкоросомами
2. Белковый состав фракции ядерных оболочек с анкоросомами
3. Иммуноцигохимический анализ сыворотхи в интерфазных ядрах гспатоцитов
4. Иммунофлуоресцеигиый анализ пролиферирующих клеток СПЭВ
5. Иммунологические характеристики афинно очищенной сыворотки
ОБСУЖДЕНИЕ
мшгши
кчетках с ДйЦШШ
3. Иммуноиитохимическое исследование белка фракции ядерных оболочек с анкоросомами в клеточном ткче.
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Протеолитическое удаление фарнетилированных и метилированных остатков в ламинах А и А дельта или их отсутствие в ламинах О и С2 может служить причиной того, что ламины А типа не входят в состав мембранных везикул, образующихся при разборке ядерной оболочки в митозе. i, i , . В интерфазном ядре сборка ламины осуществляется за счет ассоциации мономеров в гомоднмеры. i i . Рядом с каждым из концов альфа спирального участка расположены фосфорно акцепторные сайты. Специфическое фосфорилированис ссрииовых или грсониновых остатков во время митоза приводнг к деполимеризации ламннов, и, как следствие, к распаду ламины. 2 киназа, ответственная за это фосфорилированис, не влияет на распад димеров на мономеры, однако препятствует полимеризации голова к хвосту . i, . Этот эффект достигается за счет фосфорилнрования аминотерминального но не карбокситерминального фосфоакцепторного сайта . Таким образом. Другие киназы также могут фосфорилнровать ламипы в специфических сайтах и. . В частности, ф ос формирование сернна расположенною рядом с фосфоакцепторным сайтом в аминоконцсвом домене, также ингибирует ассоциацию ламинов голова к хвосту, как и 2 киназа , . Прогеинкиназа С, которая фосфорилируст сайты в С концевом домене, также можег быть ответственна за деполимеризацию ламннов в некоторых типах клеток . i, . Разные тины клеток могут использовать различные фосфорноакцеиторные сайты и различные киназы для регуляции полимеризации и деполимеризации ламинов. Ядсрная оболочка не является единственным местом локализации ламинов. Были описаны два различных способа локализации ламинов внутри ядра в виде внутренних фокусов . i . i . Л, либо В типа, или ламины, распределенные диффузно внутри ядра . . до иммуиомечения позволяет обнаружить ламины Л и С. В. диффузно распределенные внугри яфа. При помощи иммунозлектронной микроскопии было установлено, что ламины А и С в ядре локализованы в узлах нуклеоскслета. Эти данные позволяют предположить, что ламины формируют сеть также и внутри ядра. Содержащие ламины фокусы возникают и исчезают на разных стадиях клеточного цикла. При помощи мнкроииъекций человеческого л амина А в цитоплазму клеток ЗТЗ было показало, что экзогенный ламин импортируется в ядро, где сначала накапливался в дискретных фокусах глубоко внутри ядра . Только спустя несколько часов меченный ламин А постепенно включается в состав эндогенной ядерной ламины. Эти эксперименты показывают, чти эндогенная сеть ламинов может включать эхзогенные ламины. i . А типа. На основе приведенных наблюдений было высказано предположение, что фокусы представляют собой пул но вое интезиро ванных ламинов, которые необходимы для роста ядра в дочерних клетках. Кроме того, внутриядерные фокусы могут представлять собой сайты, где происходит промежуточная сборка ламинов. Возможно, что такие посттрансляционные модификации, как изопрениляния, фосфорклированкс, метилирование и иротеолитическая обработка вновь синтезируемых ламинов также имеют место в этих фокусах до их сборки и включения в периферическую ламиновую сеть . i . Внутренние фокусы существуют и лля ламина В i . Фокусы ламина В выявляются, в основном, в средней и поздней фазе и не колокализуются с фокусами ламинов АС. Фоку сы ламина В колокализуются с сайтами репликации ДНК i . Эта колокалнзация наиболее значима в свете сообщений о зависимое репликации ДНК от ядернмх ламинов, собранных в системе i vi i . Обнаружение таких внутриядерных фокусов поставило вопрос, не связаны ли они с ядерной оболочкой. Ядра многих клеток содержат инвагинации ядерной мембраны i . Эти инвагинации подстилает ядерная ламина и они содержат комплексы пор. Однако внутриядерные фокусы ламинов А и В не колокализованы с мембранами i . i . Функции фокусов ламинов А и В останутся неизвестными.