Центромерные районы хромосом и ассоциированные с ними структуры в ядрах растущих ооцитов птиц

• Автор: Красикова, Алла Валерьевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2007
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 194 с. : ил.

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Доменная организация клеточного ядра

1.2. Растущие ооциты амфибий и птиц как модельная система

для исследования структурнофункциониональной организации ядра

1.3. Внутриядерные структуры в растущих ооцитах амфибий и птиц

1.3.1. Принцип строения и особенности функционирования

хромосом на стадии ламповых щеток

1.3.2. Характеристика хромосом типа ламповых щеток птиц

1.3.3. Молекулярные компоненты ламповых щеток амфибий

1.3.3.1. Эпигенетические особенности хроматина

1.3.3.2. Белки аппарата транскрипции, процессинга
и упаковки РНК в латеральных петлях
1.3.4. Ассоциированные с хромосомами и экстрахромосомные внутриядерные тельца в ооцитах амфибий
1.3.4.1. Тельца Кахала и кластеры интерхроматиновых гранул
1.3.4.2. Терминальные и осевые гранулы на хромосомах
1.4. Строение центромерных районов хромосом
1.4.1. Центромера как структурнофункциональный домен хромосомы
1.4.2. Центромерные районы хромосом на стадии ламповых щеток
1.4.3. Центромерные белковые тела и строение кариосферы в ядрах
ооцитов птиц
2. Материалы и методы
2.1. Объекты и материал исследования
2.2. Приготовление криосрезов яичников
2.3. Приготовление препаратов хромосом типа ламповых щеток
и кариосфер
2.4. Окрашивание хромосом РНК и ДНКспецифичными флуорохромами
2.5. Непрямое иммунофлуоресцентное окрашивание
2.6. ДНКзонды для гибридизации i i
2.7. Флуоресцентная гибридизация i i
2.8. Флуоресцентная микроскопия и лазерная сканирующая
конфокальная микроскопия
2.9. Выделение ядер и получение ядерного экстракта
2 Электрофоретическое разделение белков и их окрашивание в геле
2 Иммуноблоттинг
2 Компьютерные методы исследования
3. Результаты
3.1. Анализ молекулярного состава центромерных белковых тел на
ламповых щетках птиц в сравнении с составом телец Кахала и
кластеров интехроматиновых гранул
3.1.1. Распределение фосфорилированной и нефосфорилированной
форм РНКполимеразы II на хромосомах типа ламповых щеток птиц
3.1.2. Распределение факторов, участвующих в сплайсинге
и 3процессинге премРНК, на хромосомах типа ламповых щеток птиц
3.1.3. Поиск белков, входящих в состав телец Кахала и ядрышек, на хромосомах типа ламповых щеток и в центромерных белковых телах
3.2. Распределение белков структурного поддержания хромосом в ядрах растущих ооцитов птиц
3.2.1. Локализация ДНК топоизомеразы II на хромосомах типа
ламповых щеток и в ассоциированных структурах
3.2.2. Локализация субъединиц комплекса когезин на хромосомах
типа ламповых щеток и в ассоциированных структурах
3.2.3. Локализация белков синалтонемного комплекса на хромосомах
типа ламповых щеток и в ассоциированных структурах
3.2.4. Внутриядерное распределение ДНК топоизомеразы II и белков, участвующих в когезии сестринских хроматид, в ооцитах голубя и
зяблика
3.2.5. Цитохимический анализ уровня фосфорилирования белков на хромосомах типа ламповых щеток птиц и в ассоциированных структурах
3.3. Молекулярные компоненты белкового остова кариосферы
в ядрах ооцитов зяблика
3.4. Локализация субъединиц комплекса когезин на хромосомах
типа ламповых щеток и в осевых гранулах у иглистого тритона
3.5. Маркеры центромерных районов хромосом типа ламповых щеток
птиц отряда i
3.5.1. Локализация субъединиц комплекса когезин на хромосомах
типа ламповых щеток курицы, перепела и индейки
3.5.2. Доказательство центромерного положения структур, обогащенных белками когезии, на хромосомах типа ламповых щеток курицы
3.6. Картирование центромер на ламповых щетках домашней курицы
i и японского перепела ix ix i
3.7. Распределение метилированного цитозина и белков гетерохроматина
1 а и 1 р в хроматине ламповых щеток птиц
4. Обсуждение
4.1. Принципы структурного поддержания хромосом
на стадии ламповых щеток
4.2. Особенности морфофункциональной организации
центромерных районов хромосом в ядрах растущих ооцитов птиц
4.2.1. Молекулярные компоненты и возможный механизм
формирования центромерных белковых тел
4.2.2. Формирование центромерных белковых тел типично
для стадии ламповых щеток
4.2.3. Доменная организация центромерных районов
хромосом на стадии ламповых щеток
4.3. Хромосомы на стадии ламповых щеток как инструмент для цитогенетического анализа с высокой степенью разрешения
4.4. Предполагаемые функции центромерных белковых тел
в ядрах ооцитов
Выводы
Список литературы


Примечательно, что в случае теплового шока, например в клетках человека, центромерные районы хромосом изменяют свой эпигенетический статус ii . В них начинается активная транскрипция сателлита III, синтезируется полиаденилированная РНК, в результате чего образуются специализированные домены, называемые ядерными стресстельцами i Vi . Синтезируемая некодирующая РНК сателлита П1, накапливающаяся в стресстельцах, привлекает фактор сплайсинга 2 ii . Установлено, что ядра самых разнообразных клеток содержат такую структуру, так называемый ядерный матрикс, который может служить динамическим морфологическим остовом ядра i, . Препараты ядерного матрикса можно получить при удалении из изолированных ядер мембран ядерной оболочки, хроматина и белков ядерного сока , , однако i viv наблюдать соответствующие структуры не удается. В основном такие препараты состоят из ядерной ламины, остаточного ядрышка и внутренней сети РНПфиламентов, связанных с ламиной. Белки ядерного матрикса выполняют, повидимому, не только архитектурную, но и регуляторную функцию в процессах репликации и транскрипции ДНК, участвуют в ядерноцитоплазматическом транспорте, пространственной организации хромосомных территорий, поддержании структуры митотических и мейотических хромосом и в других процессах обзор , . Исключительно удобными и широко используемыми модельными объектами для изучения структуры и функции эукариотического ядра и других общебиологических проблем являются растущие ооциты амфибий и птиц обзоры , , , . Во многом это обусловлено гигантскими размерами как самих ооцитов, так и их ядер, достигающих 0 мкм в диаметре, что более чем в раз превышает средние размеры ядер соматических клеток. Именно эти свойства ооцитов курицы позволили при исследовании их с помощью простой лупы впервые обнаружить и описать ядро зародышевый пузырек i, , цит. Другим преимуществом ооцитов амфибий и птиц является возможность микрохирургического выделения диплотенных ядер и затем внутриядерных структур обзор , , . Благодаря этим качествам ядра ооцитов амфибий на протяжении многих лет служат удобным объектом для исследования различных внутриядерных органелл. Квасов и др. Изучению ядрышек в ооцитах амфибий способствовало открытие явления амплификации генов рРНК, приводящей к появлению сотен экстрахромосомных ядрышек , . Амплифицированные гены рРНК в экстрахромосомных ядрышках послужили удобным объектом для разработки метода гибридизации i i , , , который стал одним из наиболее широко используемых технологий в молекулярной цитогенетике. Исследованию динамики экзогенных меченых молекул во внутриядерных структурах ооцитов амфибий при помощи современных цитомолекулярных методов способствует несложная техника проведения микроинъекций как в цитоплазму, так и в ядро ооцита например, работы . В таких исследованиях растущие ооциты могут быть предпочтительнее соматических клеток также в связи со значительно большими размерами органелл, содержащихся внутри их ядер. Наиболее существенным преимуществом растущих ооцитов амфибий и птиц является то, что хромосомы в них преобразуются в так называемые ламповые щетки, которые, также как и ядра ооцитов, можно изолировать при помощи несложных микрохирургических манипуляций. Хромосомы на стадии ламповых щеток это гигантские структуры рисунок 1, в которых часть ДНК вытянута в латеральные петли, легко видимые в световом микроскопе , , . Гагинская, 6. Многие фундаментальные знания о строении и функционировании хромосом получены с использованием ламповых щеток в качестве модельной системы. Так, на примере ламповых щеток амфибий Дж. Голл впервые продемонстрировал, что каждая хроматида состоит из одной двунитевой молекулы ДНК , . Ключевой особенностью хромосом типа ламповых щеток, объясняющей их привлекательность для исследователей, является их высокая транскрипционная активность. Одна из первых иллюстраций центральной догмы молекулярной биологии о том, что РНК синтезируется на матрице ДНК, была ярко продемонстрирована с использованием ламповых щеток, в которых вновь синтезированные транскрипты появляются на латеральных петлях обзоры , , .