Деградация фосфатазы CDC25A в клетках линии Hela: механизм и влияние на клеточный цикл

• Автор: Голоудина, Анастасия Равильевна
• Шифр специальности: 03.00.25
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 114 с.

СОДЕРЖАНИЕ

ГЛАВА 1. ВВЕДЕНИЕ.

1.1. Актуальность проблемы

1.2. Цели и задачи исследования

1.3. Основные положения, выносимые на защиту.

1.4. Научная новизна работы

1.5. Теоретическое и практическое значение работы

1.6. Апробация работы

1.7. Объм и структура диссертации

ГЛАВА 2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

2.1. Регуляция клеточного цикла

2.1.1. Циклинзависимые киназы и регуляция их активности
2.1.1.1.Регуляция активности циклинкиназных комплексов
с помощью регуляторной субъединицы циклина
2.1.1.2. Регуляция активности циклинзависимых киназ путем
их фосфорилирования.
2.1.1.3. Регуляция активности циклинзависимых киназ путем связывания с ингибиторами.
2.2. Контрольные точки клеточного цикла
4 2.2.1. Роль белков АТМ, АТЯ и их мишеней в функционировании
контрольных точек.1
2.2.2. Роль р МАРК в функционировании контрольных
2.2.3. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе С.
2.2.4. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в
2.2.5. Молекулярные механизмы остановки клеточного цикла в фазе вг.
2.3. Фосфатазы Сс1с структура и функции.
2.3.1. Фосфатаза СбсС.
2.3.2. Фосфатаза Сс1сВ
2.3.3. Фосфатаза Сс1сА
2.3.3.1. Регуляция активности фосфатазы Сс1сА путем фосфорилирования
2.3.3.2. Механизм протеасомной деградации фосфатазы
т .
2.3.3.3. Регуляция активности фосфатазы путем связывания с белком ЗЗа.
2.4. Клетки линии
ГЛАВА 3. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА.
3. 1. Получение клеточных линий с индуцибельной экспрессией различных форм фосфатазы и их культивирование
3.2. Плазмиды и сайтспецифический мутагенез.
3.3. Облучение клеток, вызов осмотического шока, обработка клеток ингибиторами киназ, ингибиторами белкового синтеза и протеасомной деградации
3.4. Анализ содержания белков методом иммуноблоттинга
3.5. Определение скорости синтеза ДНК
3.6. Подавление экспрессии киназы с помощью
i к .
3.7. Анализ функциональной активности мутантной формы фосфатазы i vi
3.8. Определение количества митотических клеток
г 3.9. Анализ распределения клеток по фазам клеточного
3 Анализ функциональной активности
циклинкиназных комплексов i vi.
ГЛАВА 4. РЕЗУЛЬТАТЫ
4.1. Замена на отменяет деградацию в делящихся клетках
4.2. Деградация фосфатазы после повреждения ДНК зависит от фосфорилирования по .
4.3. Разные киназы отвечают за деградацию после различных стрессовых воздействий.
4.4. Анализ уровня фосфорилирования фосфатазы после различных стрессовых воздействий.
4.5. Анализ распределения по фазам цикла клеток , экспрессирующих различные формы .
4.6. Киназы р и участвуют в остановке синтеза ДНК после стрессовых воздействий.

4.7. Клетки останавливают синтез ДНК после облучения,
несмотря на присутствие постоянно активной А.
4.8. Киназы р и участвуют в остановке клеточного цикла на границе перехода 2М после стрессовых воздействий.
4.9. Экспрессия стабильной формы позволяет увеличить количество клеток, преодолевших контрольную точку 2 после стрессовых воздействий
4 Анализ активности циклинзависимых киназ 2 и 2 в клеточных линиях, экспрессирующих различные формы фосфатазы
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ.
5.1. Изучения сайтов фосфорилирования , участвующих в регуляции ее стабильности.
5.2. Разные киназы фосфорилируют после разных стрессовых воздействий
5.3. Анализ осуществления клетками контрольных точек
ВЫВОДЫ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


В случае повреждения ДНК прохождение клетки по циклу может быть остановлено в контрольных сверочных точках клеточного цикла на границах перехода С5, М и в митозе. Таким образом клетка получает возможность исправить полученные повреждения и не допустить передачу дочерним клеткам мутационных изменений ДНК. Семейство фосфатаз С3с управляет прохождением по клеточному циклу, дефосфорилируя и активируя циклинзависимые киназы. Известно три фосфатазы семейства С3с А, В и С. В1 при переходе 2М iv, , i . Работа фосфатаз семейства строго контролируется, так как их постоянная активность может привести к ускорению прохождения клетки по циклу. Поэтому после завершения перехода из одной фазы клеточного цикла в другую происходит инактивация фосфатаз, которые принимали участие в этом процессе. То же самое наблюдается при остановке клеточного цикла в ответ на стрессовые воздействия. ЗЗа. После образования комплекса фосфатаз с белком 3Зо они
переходят из ядра в цитоплазму, таким образом пространственно разъединяясь со своими мишенями ii . Известно, что после повреждения ДНК фосфорилирование и дезактивация фосфатазы осуществляется киназой . МАРК iiv i i vi . Регуляция активности фосфатазы в делящихся клетках и в ответ на стрессовые воздействия осуществляется путем убиквитинзависимой протеасомной деградации i . Деградация
приводит к повышению уровня фосфорилирования циклинкиназных комплексов, что, в свою очередь, приводит к остановке клеточного цикла. Однако вопрос о сайтах Сс1сА, фосфорилирование которых запускает каскад событий, приводящий к ее деградации, оставался открытым. Фосфорилирование фосфатазы СбсА млекопитающих по Бег 3 вызывает деградацию белка после действия ионизирующей радиации Ра1ск е1 а. Однако для Сс1сА шпорцевой лягушки Хепори 1аеу1з сайтом, фосфорилирование по которому необходимо для деградации белка, оказался 8ег соответствующий 8ег млекопитающих, в то время как аналог Бег 3 у Хепориэ 1аеу1з никак не влиял на стабильность С1сА БЫтШа е а. Цели и задачи исследования. Целью настоящей работы было изучение регуляции стабильности фосфатазы Сс1сА и функционального значения этого процесса в клеточном цикле. Сс1сА и изучить ее способность к регуляции клеточного цикла в ответ на стрессовые воздействия. Основные положения, выносимые на защиту. Для протеасомной деградации фосфатазы Сс1сА необходимо ее фосфорилирование по 8ег киназой СЬк1 в нормальных условиях и после повреждения ДНК и киназой р после действия осмотического шока. Активность киназ р и СЬк 1 вызывает остановку синтеза ДНК в облученных или подвергнутых действию осмотического шока клетках. Экспрессия стабильной формы Сс1сА мутация по 8ег способствует переходу в митоз клеток, подвергнутых действию облучения или осмотического шока, но не может предотвратить остановку синтеза ДНК. Научная новизна. Впервые показано, что мутация по 8ег делает фосфатазу СбсА человека устойчивой к деградации при нормальном прохождении клеточного цикла, а также после действия ДНКповреждающих агентов и осмотического шока. СЬк1 в фосфорилировании и регуляции стабильности фосфатазы Сс1сА. Впервые обнаружена возможность участия р МАРК в фосфорилировании СбсА. Впервые показана роль р в остановке синтеза ДНК в ответ на облучение ультрафиолетом и осмотический стресс. Впервые показана возможность прохождения контрольной точки на границе фаз вгМ после стрессовых воздействий клетками, экспрессирующими стабильную форму фосфатазы Сс1сА . Теоретическое и практическое значение работы. Данные, полученные в настоящем исследовании, позволили выяснить механизмы деградации фосфатазы СссА и роль этого процесса в регуляции событий клеточного цикла. Идентифицирован сайт, фосфорилирование которого необходимо для деградации фосфатазы Сс1сА в нормальных и стрессовых условиях. Полученные стабильные клеточные линии, экспрессирующие устойчивую к деградации фосфатазу С1сА, могут быть использованы для дальнейшего изучения механизмов регуляции клеточного цикла. Апробация работы. По теме диссертации опубликованы 4 печатные работы 3 статьи.