Идентификация и анализ функциональных свойств кэтчина-белка гладких мышц двустворчатых моллюсков

• Автор: Кумейко, Вадим Владимирович
• Шифр специальности: 03.00.25, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Владивосток
• Количество страниц: 135 с. : ил

Введение

Глава 1. Регуля торные механизмы запирательного тонуса мышц

Обзор литературы

1.1. Функциональные состояния возбудимых клеток и феномен запирательного тонуса гладких мышц

1.2. Морфофизиологические особенности запирательных мышц

1.2.1. Запирательные мышцы как объекты исследований

1.2.2. Морфология, иннервация и фармакологические свойства клеток запирательных мышц

1.2.3. Запирательный тонус особое физиологическое состояние мышц

1.3. Структура сократительного аппарата гладких запирательных мышц

1.4. Ранние гипотезы запирательного тонуса

1.5. Парамиозин и его роль в регуляции работы гладких мышц

1.6. Регуляторная система гладких мышц, ассоциированная с миозином
1.6.1. Механизм АТФазного цикла миозина
1.6.2. Регуляция работы гладких мышц позвоночных
1.6.3. Регуляция сокращения гладких запирательных мышц беспозвоночных
1.7. Актин и актинсвязанная регуляторная система гладких мышц
1.8. Поиск новых механизмов регуляции запирательного тонуса мышц моллюсков
Глава 2. Материалы и методы
2.1. Объекты исследован ия
2.2. Препаративные методы
2.2.1. Выделение и очистка кэтчина из гладких мышц ШгиЪореМеп уе8яоепз и i
2.2.2. Выделение и очистка кальдесмона из мускульного желудка цыпленка
2.2.3. Выделение парамиозина из поперечнополосатых мышц ШгиИореМеп уезхоепз
2.2.4. Выделение кальмодулина из препаратов головного мозга свиньи
2.2.5. Выделение фракции сократительного аппарата гладких мышц i уеьзоетк
2.2.6. Получение изолированных миофибрилл из поперечнополосатых мышц Штиюрееп уеььоепш
2.2.7. Выделение регуляторных легких цепей миозина из фракции сократительного аппарата гладких мышц ШтИореМеп уеяяоети
2.2.8. Выделение миозина из фракции сократительного аппарата гладких мышц КИтюрес1еп уеоети
2.2.9. Выделение регуляторных легких цепей из препаратов очищенного гладкомышечного миозина
2.2 Конъюгация кэтчина и кальдесмона с изотиоцианатом флуоресценна
2.3. Аналитические методы
2.3.1. Исследование сайтов взаимодействия кэтчина и кальдесмона с миофибриллами из поперечнополосатых мышц приморского гребешка методами фазовоконтрастной и люминесцентной микроскопии
2.3.2. Регистрация сократительной активности миофибрилл
2.3.3. Исследование влияния кэтчина и кальдесмона на сократительную и АТФазную активности моделей
2.3.4. Количественное определение неорганического фосфата
2.3.5. Анализ белковых препаратов с помощью гельэлектрофореза в присутствии додеци л сульфата натрия
2.3.6. Анализ белковых препаратов с помощью гельэлектрофореза в присутствии 8 М мочевины
2.3.7. Модифицированная методика электрофореза в присутствии мочевины
2.3.8. Анализ взаимодействия белков методом неденатурирующего электрофореза
2.3.9. Анализ белковых препаратов методом двумерного электрофореза в полиакриламидном геле
2.3 Определение содержания белка микробиуретовым методом
2.4. Получение антител и иммунохимический анализ
2.4.1. Получение поликлональных антител против кэтчина МхгикореМепуезхоепзхз
2.4.2. Иммунохимический анализ
Глава 3. Результаты исследования
3.1. Идентификация нового высокомолекулярного белка гладких мышц двустворчатых моллюсков
3.1.1. Идентификация термостабильпого высокомолекулярного компонета аддукторных мышц АНгикоресХеп уеххоетй методом ДСэлсктрофорсза в ААГс
3.1.2. Анализ взаимодействия кэтчина и катьдесмоиа с кальмодулином
3.1.3. Локализация участков связывания кэтчина и кальдесмона с изолированными миофибриллами поперечнополосатой мышцы аддуктора МкикореМеп уеззоапп
3.1.4. Сравнительный иммунохимический анализ кэтчина
3.1.5. Исследование взаимодействия кэтчина с регуляторными легкими цепями миозина
3.2. Исследование влияния кэтчина на параметры
сократительной активности изолированных миофибрилл
3.2.1. Типы используемых молекулярных сократительных моделей
3.2.2. Влияние кэтчина и кальдесмона на параметры сократительной активности нативных миофибрилл
3.2.3. Влияние кэтчина на параметры сократительной активности десенсибилизированных миофибрилл
3.2.4. Влияние кэтчина на параметры сократительной активности глицеринизированных миофибрилл
3.2.5. Общий анализ влияния кэтчина на сократительную активность миофибрилл
3.3. Влияние кэтчина на 1УАТФазную активность изолированных миофибрилл
3.3.1. Исследование кинетики МАТФазной активности изолированных нативных миофибрилл
3.3.2. Исследование влияния кэтчина на МАТФазную активность изолированных нативных миофибрилл
3.3.3. Сравнительный анализ влияния кэтчина на АТФазную активность нативных и десенсибилизированных миофибрилл
3.4. Влияние различных факторов на регуляцию кэтчином функциональных свойств изолированных миофибрилл и толстых нитей
Глава 4. Обсуждение результатов
4.1. Кэтчин белок, специфичный для гладких запирательных мышц моллюсков
4.2. Кэтчин белок толстых филаментов сократительного аппарата
4.3. Кэтчин обладает частичным структурным сходством с миозином
4.4. Кэтчин проявляет регуляторные свойства
Заключение
Список литературы
Список принятых сокращений
АДФ аденозин5дифосфат.
АТФ аденозин5трифосфат.
дсн додецилсульфат натрия.
ДР диализный раствор
К константы скоростей процессов
км кальмодулин
КР контрольный раствор
ОР отмывающий раствор
ПААГ полиакриламидный гель
ПМ парамиозин
РЛД регуляторные легкие цепи миозина
СА сульфат аммония
Грис трисоксиметиламинометан.
ТЕМЭД КЫ,М тетраметилэтилендиамин.
ФМСФ фенилметилсульфонил фторид.
ЭБ экстрагирующий буфер
ЭГТА этиленгликольбис2аминоэтиловый эфир ,, ,Г тетрауксусной кислоты.
ЭДТА этилендиамингетрауксусная кислота.
ЭлБ элюирующий буфер
Р неорганический фосфат
ВВЕДЕНИЕ


Впервые показано, что обнаруженный компонент запирательных мыши является отдельным белковым продуктом, который не может быть отнесен к кальдесмону и подобным ему белкам, не является специфической формой парамиозина и проявляет лишь частичное иммунохимичсское сходство с миозином, от которого отличается по целому ряду свойств. Мы установили, что, отличаясь от миозина молекулярной массой 5 кОа, термостабильностью, не обладая собственной гидролазной активностью, белок способен взаимодействовать со структурой толстых миозинпарамиозиновых нитей сократительного аппарата, оказывая влияние на его АТФазную и сократительную активности. Представленные данные хорошо согласуются с результатами других исследователей Уатаба, БЬсЬсГко а1, . Было установлено, что неизвестный компонент запирательных мышц моллюсков является отдельным белковым продуктом гена миозина, получаемым в ходе альтернативного сплайсинга его первичного транскрипта Уатаба е1 а. В отличие от работы А. Ямада и соавторов, мы исследовали собственно свойства самого нативного белка, выделенного в чистом виде, и потому результаты обоих направлений исследований дополняют друг друга и вносят теоретический вклад в изучение регуляции и функционирования запирательных мышц животных. В данной диссертационной работе мы называем новый белок кэтчином, используя название, предложенное группой Ямада . Результаты, представленные в диссертационной работе, вносят практический вклад в методологию и дальнейшую стратегию исследования свойств нового белка, особенностей функционирования сократительного аппарата мышц, регуляции их перехода из одного физиологического состояния в другое. Предложен метод получения поликлональных антител против кэтчина, которые в дальнейшем помогут исследовать его тонкую ультраструктурную организацию и локализацию. Другие результаты работы, возможно, позволят i vi моделировать полный цикл работы запирательных мышц и могут быть привлечены для понимания патологических или специфических изменений свойств мышц. Так, подобпое состояние, называемое в данном случае , обнаружено в ряде гладких мышц позвоночных и человека, причем наиболее ярко проявляется при некоторых патологических расстройствах. Публикации. По теме диссертации опубликованы 4 работы. Объем и структура работы. Диссертация изложена на 5 страницах и включает введение, 4 главы с рисунками и таблицами, заключение и выводы. Список цитируемой литературы содержит 7 наименований. Апробация работы. Материалы работы были представлены на Европейской мышечной конференции г. Института биологии моря ДВО РАН , , гг. Владивосток, Региональных естественнонаучных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых , гг. Владивосток. ГЛАВА 1. Функциональные состояния возбудимых клеток и феномен запирательного тонуса гладких мышц В процессе своей жизнедеятельности клетки постоянно взаимодействую между собой и с окружающей средой, воспринимая специфические и неспецифические воздействия и отвечая на них соответствующим образом. Среди наиболее значительных ответных реакций па раздражители физиологи выделяют реакцию возбуждения, проявляющуюся в отчетливой внешней деятельности специализированных клеток и характеризующуюся детерминированным переходом из одного физиологического состояния в другое. Для большинства возбудимых клеток принято выделять два основных физиологических функциональных состояния возбуждения и покоя для нервных клеток, и активного сокращения и расслабления для мышечных клеток. Однако, еще в конце XIX начале XX столетий ряд исследователей отметили, что клетки некоторых гладких мышц животных обладают уникальной физиологической функцией они способны развивать большую силу в период активного состояния, а затем длительное время пребывать в состоянии повышенного тонуса, на поддержание которого расходуют крайне мало энергетических запасов клетки. Это свойство было впервые обнаружено у мускулов аддукторов раковин двустворчатых моллюсков и получило название в физиологической литературе того периода нем. Среди первых работ, посвященных запирательному тонусу мышц, следует отметить работы И. П. Павлова vv, , Парнаса , , Юксюоля x, .