Участие некоторых грибных ферментов в биодеградации лигноцеллюлозных субстратов

• Автор: Дзедзюля, Екатерина Игоревна
• Шифр специальности: 03.00.24
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 117 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ

ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ

1. Полисахариды клеточной стенки

1.1. Целлюлоза.

1.2. Гемицеллюлозы.

1.3. Пектиновые вещества.

2. Лигнин
ГЛАВА 2. МИКРОБИОЛОГИЧЕСКАЯ ДЕСТРУКЦИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ.
ГЛАВА 3. ФЕРМЕНТЫ, ПРИНИМАЮЩИЕ УЧАСТИЕ
В БИОКОНВЕРСИИ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ
1. Гидролитические ферменты.
1.1. Карбогидразы
1.2. Эстеразы
1.2.1. Ацетилксилашстеразы.
1.2.2. Ферулоилэстераза
2. Окислительные ферменты.
2.1. Лигнинпероксидаза.
2.2. Млзависимая пероксидаза
2.3. Мпингибируемая пероксидаза.
2.4. Фенолоксидазы тирозиназа и лакказа
2.5. Арилалкогольоксидаза
3. Перекнсьпродуцирующие ферменты, окисляющие
углеводы
ГЛАВА 4. НЕФЕРМЕНТАТИВНЫЕ МЕХАНИЗМЫ ОКИСЛЕНИЯ ЛИГ НИНА
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
ГЛАВА 5. ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
5.1. Объекты исследования
5.2. Выделение чистых культур . i, . .
5.3. Условия культивирования грибов белой гнили
5.4. Приготовление инокулюма и отбор проб
КЖ грибов белой гнили.
5.5. Исследование ММР лигносульфонатов КЖ грибов белой гнили и продуктов гидролиза природных субстратов
ферулоилэстеразой . методом ГПХ
5 6. Методы измерения ферулоилэстеразной активности.
Предобработка природных субстратов для действия
ферулоилэстеразы.
5.6.1. Гидролиз метилового эфира феруловой и лкумаровой
кислот.
5.6.2. Гидролиз ферулоиларабинозида
5.6.3. Гидролиз природных субстратов.
5.6.4. Определение общего содержания феруловой
кислоты в составе природных субстратов.
5.6.5. Обращеннофазовая хроматография
5.6.6. Определение деацетилирующей активности
5.7. Методы определения ксиланазной активности.
5.7.1. Гидролиз КМЦ и глюкуроноксилана березы
5.7.2. Гидролиз МУФпроизводных
5.7 3. Гидролиз пНФ производных.
5.8. Определение и температурного оптимумов
ферулоилэстеразы и ксиланазы .
5.9. Методы определения пероксидазной активности
5.9.1. Окисление , температурная стабильность.
и оптимум МП В. .
5.9.2. Окисление фенолового красного
5.9.3. Активность по отношению к гваяколу.
5.9.4. Определение активности МП по отношению к другим субстратам
5 Методы определения пероксидазной и
лакказной активности.
5 . Определение лигнинпероксидазной активности.
5 Определение арилалкогольоксидазной активности
5 . Выделение гомогенной пероксидазы В.
. Ионообменная хроматография
. Хроматофокусированне
5 Выделение гомогенной ферулоилэстеразы и
ксиланазы . .
. Ионообменная хроматография
. Выделение ферулоилэстеразы . методом гидрофобной хроматография.
. Выделение ксиланазы . методом гиброфобной хроматографии.
5 ДДСГ1ААГ электрофорез и изоэлектрофокусирование.
5. . Субстраты и реактивы
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
ГЛАВА 6. ОБЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ РОСТА ГРИБОВ
БЕЛОЙ ГНИЛИ НА СРЕДЕ С ЛИГНОСУЛЬФОНАТАМИ
6.1. Ферменты, продуцируемые грибами белой гнили.
6.2. Трансформация лигносульфонатов
иод действием грибов.
6.3. Сопоставление данных ГПХ с ферментативной
активностью грибов белой гнили.
6.4. Роль Н2О2 и супероксиданиона в процессах деструкцииполимеризации лигносульфонатов
культурой В
ГЛАВА 7. ВЫДЕЛЕНИЕ И СВОЙСТВА МпПЕРОКСИДАЗЫ
Я шдеа.
7.1 Выделение Мппероксидазы Я аЖша
7.2. Биохимические характеристики и субстратная
специфичность Мппероксидазы В. асима.
ГЛАВА 8. УЧАСТИЕ ФЕРУЛОИЛЭСТЕРАЗЫ В
БИОТРАНСФОРМАЦИИ ЛИГНИИСОДКРЖАЩИХ СУБСТРАТОВ
8.1. Скрининг препаратов грибов класса ОеШеготусМеэ
на ферулоилэстеразную активность.
8 2. Выделение ферулоилэстеразы А. Ие1еготогрИи.
8.3. Субстратная специфичность и биохимические
характеристики ферулоилэстеразы А. Ье1егопюгрИиз.
8.4. Действие ферулоилэстеразы А. ЬаеготогрИиь
на природные лигнинсодержащие субстраты
8.5. Выделение ксиланазы1. ЬегопюгрЬкз
8.6. Субстратная специфичность и биохимические
характеристики ксиланазы А Ие1еттогрЫк.
8.7. Синергитическое действие ферулоилэстеразы и
ксиланазы А. ИееготогрИих при гидролизе пшеничных отрубей.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Несмотря на значительный прогресс в исследовании процессов биоконверсии лигнина, до сих пор не удалось воспроизвести этот процесс в присутствии гомогенных грибных ферментов i vi. Предполагается, что для успешной работы лигнолитических ферментов необходимо первичное окисление лигниновой матрицы агентами неферментной природы. В частности, отмечается необходимое участие в биоконверсии лигнина активированных форм кислорода синглетный кислород, супероксидный анион и гидроксильные радикалы. На наш взгляд, выяснение роли ферментов и неферментных эффекторов в биоконверсии лигнина возможно при культивировании грибов белой гнили на лигнинсодержащем субстрате, например лигносульфонатах. При этом важно детектировать ферментативную активность грибов, изменения, происходящие с лигнином под действием грибной культуры. Наконец, необходимо исследование свойств индивидуальных ферментов, которые принимают участие в биоконверсии лигноцеллюлозного субстрата. Относительно недавно было установлено, что многие сапротрофные дейтеромицеты особенно, представители родов i, iii, i, и др. Гидролитические ферменты ферулоил или кумароилэстеразы разрушают сложноэфирные связи, тем самым разделяя лигнин и гемицеллюлозы. Вопрос о значении и свойствах эстераз привлекает интерес, в первую очередь, в связи с широкими возможностями их применения в биотехнологических процессах пищевой, кормовой, целлюлознобумажной и других областей промышленности. Таким образом, основная цель нашей работы заключалась в выяснении роли лигнолитических ферментов и активированных форм кислорода в биоконверсии лигнина, а так же в исследовании процессов разрушения лигноуглеводного комплекса ферулоилэстеразами. Определить динамику ферментативной активности грибов белой гнили В. С. i, . Исследовать возможное участие активированных форм кислорода в биоконверсии лигносульфонатов под действием культуры В. Изучить свойства гомогенной МП, выделенной из КЖ В. Исследовать действие ферулоилэстеразы, выделенной из КЖ . ГЛАВА 1. ОСОБЕННОСТИ СТРОЕНИЯ ЛИГНОЦЕЛЛЮЛОЗНЫХ СУБСТРАТОВ. В состав клеточных стенок всех растений входят полисахариды целлюлоза, гемицеллюлоза, пектины и фенилпропановый полимер лигнин, который занимает по распространенности, второе место после целлюлозы. Кроме того, в клеточной стенке могут присутствовать белки и минеральные элементы. Растения имеют первичную и вторичную клеточную стенку. В процессе формирования клеток первоначально возникает протопектиновая пластинка, которая служит основой первичной клеточной стенки, на она состоит из полисахаридов целлюлозы содержание которой может составлять до , гемицеллюлозы и пектинов оставшиеся составляют белкигликопротеины. Ригидную основу первичной стенки составляют микрофибриллы целлюлозы, каждая из которых покрыта слоем ксилоппокана гемицеллолозы. Строение линейной глюкановой части этого полимера идентично целлюлозе, благодаря чему между ними образуются водородные связи. Боковые цепи ксилоглюкана ориентированы перпендикулярно микрофибриллам целлюлозы и ковалентно присоединены к молекулам арабиногалактана, который в свою очередь, соединяется с пектином рамногалактуронаном. Таким образом, в первичной клеточной стенке гемицеллюлозы обеспечивают связь целлюлозы с пектином. С возрастом на внутренней стороне первичной клеточной стенки формируется вторичный слой, содержащий лигнин. Содержание целлюлозы здесь составляет не менее , а содержание лигнина в одревесневших тканях может достигать до . Одна из особенностей формирования вторичной клеточной стенки в том, что микрофибриллы целлюлозы образуются раньше лигниновой матрицы. Это является причиной формирования сложных лигноуглсводных комплексов, в которых лигнин и гемицеллюлозы связаны ковалентно. В частности, просгые эфирные связи соединяют лигнин с гидроксильными группами глюкозы, маннозы, ксилозы, сложноэфирные с карбоксильными группами кислот в составе гемицеллюлоз уроновая, гидроксикоричные кислоты , , 1. Таким образом, связь лигнина с целлюлозой во вторичной стенке также происходит через промежуточный слой гемицеллюлоз.