Разработка методов получения рекомбинантных белков-цитокинов на примере γ-интерферона, интерлейкина-3 и фактора некроза опухолей- α

• Автор: Печенов, Сергей Евгеньевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 135 с. : ил.

1. Литературный обзор Методы получения рекомбинантных белков, структура и свойства фактора некроза опухолейа, уинтерферона и интерлейкина3.

1.1 Методы получения рекомбинантных белков.

1.1.1 Выбор системы экспрессии при получении

рекомбинантных белков

1.1.2 Ренатурация белка i viv в . i.

1.1.3 Ренатурация i vi белков, экспрессируемых в

. i в виде тел включения

1.2 Фактор некроза опухолей альфа структура и свойства

1.2.1 Продукция фактора некроза опухолей человека аФНО.

1.2.2 Молекулярная структура аФНО

1.2.3 Биологически активная форма аФНО.

1.2.4 Изучение функционально важных участков
молекулы аФНО.
1.2.5 Механизмы противоопухолевого и
цитотоксического действия аФНО.
1.2.6 Токсичность аФНО.
1.2.7 Методы получения аФНО
1.3 Гаммаинтерферон структура и биологическое действие
1.3.1 Анализ первичной структуры гаммаинтерферона
уИФН.
а Анализ последовательности нуклеотидов гена
б Последовательность аминокислот природного уИФН
в Последовательность аминокислот рекомбинантного уИФН из трансформированных клеток . i.
1.3.2 Вторичная и третичная структура уИФН.
1.3.3 Влияние С и концевых аминокислотных последовательностей молекулы уИФН на
конформацию и биологическую активность.
1.3.4 Механизм биологического действия уИФН.
1.3.5 Стабильность уИФН и методы ее повышения.
1.3.6 Методы выделения и очистки уИФН,
экспрессируемого в . i. .
1.4. Интерлейкин3 структура и биологическое действие.
1.4.1 Биосинтез ИЛ3 клетками
1.4.2 Молекулярная структура ИЛ3
1.4.3 Механизм биологического действия ИЛ3
1.4.4 Методы выделения и очистки ИЛ3, экспрессируемого . i.
2. Обсуждение результатов
2.1 Разработка метода выделения и очистки аФНО
2.1.1 Разработка метода выделения и очистки
аФНО дикого типа.
2.1.2 Выделение и очистка мутантного аФНО.
2.2 Выделение и очистка уИФН. Получение стабильных аналогов
уИФН и их исследование
2.2.1 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации
уИФН дикого типа.
2.2.2 Получение мутантных аналогов уИФН и исследование их свойств.
2.2.2.1 Выделение, очистка и ренатурация мутантных аналогов уИФН.
2.2.2.2 Изучение влияния введения дисульфидной связи, Сконцевого укорочения и концевой
замены и их комбинаций на свойства уИФН
2.3 Разработка метода выделения, очистки и ренатурации ИЛ3 человека, экспрессируемого в клетках . i.
2.4 Исследование ренатурации.
2.4.1 Исследование влияния параметров реакционной среды.
2.5.1.1 Влияние клеточных компонентов
2.4.1.2 Влияние реакционной среды.
2.4.1.3 Влияние концентрации белка и температуры среды.
2.4.1.4 Влияние окислительновосстановительного потенциала.
2.4.1.5 Влияние природы реакционной среды.
2.4.2 Кинетика ренатурации.
2.5 Унифицированная схема получения рекомбинантных белков
3. Экспериментальная часть.
4. Выводы
5. Список цитированной литературы.
Список сокращений
БСА бычий сывороточный альбумин РМЭ рмеркаптоэтанол ДСН додецилсульфат натрия
ДСНГЭФ гельэлектрофорез в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия КД круговой дихроизм ПААГ полиакриламидный гель
ТрисНС1 трисгидроксиметиламинометан гидрохлорид
ТХУ трихлоруксусная кислота
ТФУ трифторуксусная кислота
УФ ультрафиолетовая часть спектра
РМвБ параметилсульфонил фторид
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота натриевая соль
офВЭЖХ обращеннофазовая высокоэффективная жидкостная
хроматография
иоВЭЖХ ионообменная ВЭЖХ эВЭЖХ эксклюзионная
Введение


Обладая такой системой синтеза и процессинга белка, животные клетки кажутся самыми подходящими для получения многих лекарственных белков. Первоначальный выбор такой системы возник изза недостатка знаний о животных клетках. Позже выяснилось, что системы экспрессии на основе эукариотических клеток имеют потенциальные ограничения возможностей синтеза белка. Вопервых, животные клетки требуют длительного времени культивирования около 7 дней для достижения максимальной плотности клеточной культуры, которая при этом достигает существенно меньших значений 1 x6 клетокмл, чем у бактериальных клеток 8 клетокмл. Вовторых, шапероны могут мешать ренатурации при попытках достичь суперэкспрессии белка. Когда клетка в больших количествах производит целевой белок, шапероны не могут полностью выполнять свои функции, при этом внутри клетки накапливается частично ренатурированный белок. Такие случаи наблюдались как для прокариот, так и для эукариот , . Можно также добавить, что животные клетки растут на дорогих средах, содержащих компоненты, способные снижать выход целевого белка. Высокая стоимость ферментации, технические трудности и, часто, низкий уровень экспрессии в животных клетках обусловили преимущественное использование бактериальных клеток для производства белков. Использование бактериальных систем экспрессии позволяет избежать некоторых проблем, свойственных животным клеточным системам. Экспрессия рекомбинантных белков в . В биотехнологии успешно реализовано получение некоторых белков, ренатурированных i viv в бактериальных клетках. Однако большинство бактериальных систем не способны секретировать большие белки в культуральную среду и их клеточный аппарат, как правило, не способствует полной ренатурации рекомбинантного белка. При высоком уровне экспрессии часто образуются так называемые тела включения. Такие белковые агрегаты солюбилизируют и ренатурируют i vi с целью получения нативного белка. Так как эффективность выделения, отмывки и солюбилизации тел включения достаточно высока, выход ренатурированного i vi белка часто является лимитирующим фактором при его получении. Ренатурация белков является сложным процессом образования нативной пространственной структуры белковой молекулы. Несмотря на значительное количество исследований в этой области и полученные важные сведения, детали процесса укладки полипептидной цепи как i viv так и i vi ещ далеки от полного понимания. В промышленной биотехнологии белков лекарственного назначения культивирование клеток, синтезирующих ренатурированный i viv белок, и ренатурация белков i vi являются ключевыми стадиями технологического процесса. Разработка схем их выделения, очистки и ренатурации является многомерной и достаточно сложной задачей. Ренатурация белка i viv в . Для получения или увеличения выхода ренатурированного i viv белка некоторые исследователи модифицировали условия роста клеток . Простейшая модификация условий роста клеток изменение температуры. Биосинтез мутантного белка хвостового шипа фага р приводит к образованию термолабильных интермедиатов, которые при С агрегируют с образованием нерастворимых тел включения, а при С ренатурируют с образованием нативного белка. Таким образом, если образование тел включения управляется эндотермическими процессами, такими как гидрофобные взаимодействия, то в процессе проведения ферментации следует избегать повышения температуры. Другим важным фактором в получении ренатурированных i viv белков в Е. Исследования i и сотрудников показали, что на формирование тел включения может сильно воздействовать добавление в культуральную среду не входящих в клеточный метаболизм сахаров, таких как сахароза и рафиноза. Было показано, что образование периллазматических тел включения 3лактамазы сильно снижалось при добавлении этих сахаров в культуральную среду. Определенные изменения на клеточном уровне могут приводить к получению ренатурированного i viv белка. К таким изменениям относятся суперэкспрессия шаперонов в клетке и мутации целевого белка. Одна из первых попыток увеличения количества растворимого ренатурированного белка в . В .