Включение антигенов и ДНК в биосовместимые полимерные микросферы для применения в биомедицине

• Автор: Селина, Оксана Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 128 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращений

Введение.

Глава 1. Обзор литературы.

1.1. Способы удаления антиуглеводных антител.

1.1.1. Лекарственная терапия.

1.1.2. Инфузия антисЮа1 антител.

1.1.3. Экстракорпоральная терапия

1.1.4. Поиск новых аффинных сорбентов

1.2. Способы доставки ДНК в клетку для разработки ДНКвакцин.

1.2.1. Электропорация

1.2.2. Введение ДНК с помощью микроинъекции
1.2.3. Метод генной пушки
1.2.4. Введение нативной ДНК с помощью прямых инъекций.
1.2.5. Введение ДНК с помощью различных транспортных систем
1.2.5.1. Вирусные векторы
1.2.5.2. Белковые и пептидные векторы
1.2.5.3. Введение ДНК с использованием липосом.
1.2.5.4. Введение ДНК, включенной в полимерных микрочастицы и микрокапсулы.
1.3.Капсул ированис
1.3.1. Микрокапсулы
1.3.2. Полимерные носители.
1.3.2.1.риродные полисахариды
1.3.3. Методы микрокапсулирования
1.3.3.1. Химические методы микрокапсулирования.
1.3.3.2. Физические методы микрокапсулирования.
1.3.3.3. Физикомеханические методы микрокапсулирования
1.3.4. Полиэлекролитные микрокапсулы.
1.3.4.1. Метод послойной адсорбции полиэлектролитов
1.3.4.2. Получение микрокапсул с помощью гелеобразования.
1.4. Заключение по обзору литературы.
Глава 2. Материалы, оборудование и методы исследования
2.1. Материалы и реактивы
2.2. Лабораторное оборудование.
2.3. Методы получения и исследования.
2.3.1. Получение модифицированных декстранов.
2.3.2. Определение молекулярной массы модифицированных декстранов
2.3.3. Определение степени замещения модифицированных декстранов
2.3.4. Получение альгинатполикатионных микросфер
2.3.5. Определение толщины мембраны микросфер
2.3.6.0пределеиие эффективности включения гликоконъюгата в
микросферы.
2.3.7. Изучение эффективности сорбции антител микросферами с различной толщиной ПЭ мембраны.
2.3.8. Сравнение способности альгинатхитозановых микрочастиц и сефарозы специфически связывать антиуглеводные антитела
2.3.9. Проведение ИФА
2.3 Исследование гемосовместимости микрочастиц.
2 Изучение морфологии и концентрации форменных элементов крови
2 Исследование гемолиза эритроцитов
2 Определение фрагмента СЗа
2.3 Получение микрочастиц карбоната кальция
2.3 Изучение сорбционной емкости микрочастиц СаСОз.
2.3 Включение ДНК в микрочастицы СаСОз.
2.3 Получение микрокапсул на основе микрочастиц СаС методом послойной адсорбции полиэлектролитов.
2.3 Оценка эффективности введения вирусной ДНК, включенной в ПЛАЛГз микрокапсулы, в клетки в модели i vi.
2.3 Изучение доставки вирусной ДНК, включенной в ПЛАЛГ3 микрокапсулы, в клетки в модели i viv
2.3 Оценка эффективности доставки микрокапсулированных форм плазмидных ДНК в моделях i viv.
Глава 3. Результаты и обсуждение
3.1. Выбор полимеров для получения полиэлектролитных биосовместимых микросфер.
3.2. Включение антигенов в биосовместимые альгинатхитозановые микросферы для специфического удаления антиуглеводных антител
3.2.1 Выбор антигенов
3.2.2. Выбор метода иммобилизации антигенов
3.2.3. Характеристика альгинатхитозановых носителей.
3.2.4. Изучение эффективности включения гликоконъюгатов в микросферы .
3.2.5. Изучение эффективности сорбции антител микросферами.
3.2.6 Сравнение способности альгинатхитозановых микрочастиц и
сефарозы специфически связывать аитиуглеводные антитела
3.2.7. Изучение гемосовместимости микросфер
3.2.7.1. Изучение морфологии и концентрации форменных элементов крови.
3.2.7.2. Исследование гемолиза эритроцитов.
3.2.7.3. Определение фрагмента СЗа.
3.3. Включение ДНК в биосовместимые полимерные микрокаисулы
3.3.1. Выбор материалов и метода для включения ДНК.
3.3.2 Изучение сорбционной емкости микрочастиц СаС.
3.3.3. Подбор полиэлектролитов для получения мультислойных микрокапсул
3.3.4. Исследование доставки вирусной ДНК, включнной в ПЛАЛГ3 микрокапсулы, в клетки в модели i vi и i viv.
3.3.5. Исследование доставки плазмидных ДНК, включнных в микрокапсулы различного полимерного состава, в модели i viv.
Благодарности.
Список литературы


Применение таких сорбентов требует предварительной процедуры разделения крови на плазму и клетки крови плазмаферез, во избежание контакта клеток крови с сорбентом, а затем пропускание плазмы через сорбент плазмосорбция с последующим возвращением клеток и плазмы в кровоток. Такая необходимость обусловлена тем, что при пропускании через колонку с сорбентом цельной крови, взаимодействие частиц сорбента, с клетками, сопоставимыми с ними по размерам, приводит к повреждению тромбоцитов, эритроцитов и других клеток крови. Существенным недостатком такого подхода являются еще и потери в объеме крови, что требует заместительной терапии. Поэтому более привлекательным представляется метод удаления патогенных антител непосредственно из цельной крови гемосорбция. При этом особую значимость приобретает задача создания биосовместимой полимерной матрицы носителя антигена, которая бы позволила сохранить сорбционную емкость традиционных сорбентов или даже увеличить се и при этом не травмировать клетки крови за счет применения частиц большего размера. Разработка новых методов доставки ДНК в клетки является одним из актуальных направлений в биотехнологии и основной предпосылкой для создания новых ДНКвакцин. Для разработки эффективных вакцин требуется доставка белков антигена в цитоплазму антигенпредставляющих клеток АПК, к которым относятся дендритные клетки ДК, а также макрофаги и моноциты. В этом случае АПК способны индуцировать не только гуморальный иммунный ответ, то есть продукцию антител, но и цитотоксический клеточный ответ, необходимый для элиминации зараженных патогеном клеток организма. Созданная таким образом ДНКвакцина потенциально способна индуцировать клеточный и гуморальный иммунный ответ 6. Если рассматривать существующие способы введения ДНК в клетки, то большинство из них применимо только в условиях i vi, например, метод электропорации и метод генной пушки. В условиях i viv пригодными остаются только липидопосредованное введение ДНК и иммунизация нативной ДНК. Эффективность таких методов остается крайне невысокой, так как количество введенной ДНК, попадающее в АПК клетки, оказывается слишком низким для индукции иммунного ответа. Микрокапсулирование ДНК позволяет не только защитить ДНК от быстрого разрушения в организме нуклеазами, но также обеспечить адресную доставку и взаимодействие с клеточными рецепторами. Как правило, для микрокапсулирования ДНК используют метод распылительной сушки и метод двойной эмульсии водамасловода. Эффективность включения ДНК последним методом обычно не превышает . Метод распылительной сушки более эффективен, однако, использование органических растворителей например, дихлорметана, диметилсульфоксида, а также различных ПАВ может снижать биологическую активность инкапсулированных биоактивных молекул. Кроме этого метод распылительной сушки требует наличия специального дорогостоящего оборудования. Поэтому актуальной задачей является разработка новых простых и универсальных методов включения ДНК в микрокапсулы для ее доставки в клетки в условиях i viv. Целью настоящей работы являлось включение синтетических антигенов гликоконыогатов и ДНК, кодирующих белокантиген, в биосовмсстимые полимерные микросферы на основе природных полисахаридов исследование свойств полученных микросфер и возможности их применения в биомедицине для создания новых биосовместимых иммуносорбентов и ДНКвакцин. Выбрать биодеградируемые полиэлектролиты для получения микросфер. Разработать и оптимизировать методы включения синтетических антигенов гликоконъюгатов и ДНК в полиэлектролитные микросферы микрочастицы и микрокапсулы различного композиционного состава. Исследовать способность полученных микросфер с включенными антигенами сорбировать антиуглеводные антитела. Сравнить сорбционные свойства полученных микросфер и сефарозы. Изучить гемосовместимость матрицыносителя антиг ена на примере пустых полиэлектроли гных микросфер различного композиционного состава. Изучить эффективность доставки в клетки микрокапсулированной вирусной ДНК в условиях i vi и i viv. Исследовать в модели i viv индукцию антител на введение микрокапсулированных плазмидных ДНК двух типов, изучить влияние различного композиционного состава микросфер на иммунный ответ.