Механизм активации глутамилэндопептидазы Bacillus intermedius

• Автор: Гасанов, Евгений Валерьевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 83 с. : ил.

1. ВВЕДЕНИЕ

2. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

Механизмы распознавания заряженных субстратов протеолитическими ферментами.

2.1. Введение

2.2. Номенклатура, применяемая для описания взаимодействия протеазы с

субстратом.

2.3. Аспартильные протеазы.

2.4. Металл опротеазы.

2.5. Цистсиновые протеазы.

2.6. Сериновые протеазы.

2.7. Заключение.

3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
3.1. Реактивы и материалы.
3.2. Общие методы.
3.3. Конструирование плазмид для экспрессии I в клетках В. ii.
3.4. Получение нативною фермента I из клеток i ii.
3.5. Конструирование плазмид для экспрессии I в клетках . i.
3.6. Очистка рекомбинантного пропептида I
3.7. Очистка рекомбинантных вариантов I , РМ, РЕМ, М, 1, 2,
3.8. Ренатурапия и активация рекомбинантных вариантов I , РМ, РЕМ,
М, 1, 2, 3.
3.9. Электронная микроскопия
Получение пропептида I слитого с целлюлозосвязывающим доменом
целлюлазы ii
3 Ренатурация зрелых частей 1 рекомбинантам пропептидом i I
3 Обработка I аминопептидазами.
4. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
4.1. Глутамилэндопсптидаза i ii связь между распознаванием
субстрата и активацией предшественника
Изучение созревания глутамилэндонептидазы i ii
Влияние природы 1 остатка на созревание глутамилэндонептидазы i
ii.
Эффект делсции 3некодирующей области гена глутамилэндопептидазы i ii на продукцию активного белка клетками i ii
Созревание глутамилэндонептидазы i ii i vi
Автоактивация глутамилэндопептидазы В. ii
Изучение роли концевого остатка в функционировании зрелой
глутамилэндопептидазы i ii
Получение вариантов глутамилэндопептидазы i ii без
концевых остатков.
Исследование созревания глутамилэндопептидазы i ii с
собственным пропептидом в системе i
Получение глутамилэндопептидазы i ii с тремя удаленными
концевыми ос та тками.
Заключение
1ИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРА ТУРЫ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
1. I глутамилэндопептидаза i ii
2. целлюлозосвязывающий домен целлюлазы i
3. фенилметилсульфонилфторид
4. Ii трисгидроксиметиламиномстан
5. ЫбензилоксикарбонилЬглутамилянитроанилид
6. ГЭПаза глутамилэндопептидаза
7. ПААГ полиакриламидный гель
8. ПЦР полимеразная цепная реакция
ВВЕДЕНИЕ


Конструирование плазмид для экспрессии I в клетках В. Получение нативною фермента I из клеток i ii. Конструирование плазмид для экспрессии I в клетках . Очистка рекомбинантных вариантов I , РМ, РЕМ, М, 1, 2,
3. М, 1, 2, 3. Обработка I аминопептидазами. Автоактивация глутамилэндопептидазы В. Заключение
1ИСОК ЦИТИРУЕМОЙ ЛИТЕРА ТУРЫ. В современных науках о жизни значительное место занимают проблемы изучения белковых молекул, связи структуры и функции белков. Наибольшее внимание при этом привлекают каталитически активные белки ферменты. Одним из основных направлений является исследование механизмов ферментативного катализа, представляющее значительный интерес как с фундаментальной точки зрения, так и для развития биотехнологии. Важнейшим этапом функционирования ферментов является специфическое распознавание и связывание молекул субстрата. Понимание механизмов, лежащих в основе субстратной специфичности белков, позволяет управлять активностью природных ферментов, в частности, в медицинских целях. Кроме того, знание закономерностей распознавания субстрата позволяет конструировать белки с модифицированной, заданной субстратной специфичностью. Удобной моделью для исследования механизмов, определяющих субстратную специфичность, являются протеолитические ферменты. Внутри этого класса ферментов можно выделить ряды родственных белков, поразному взаимодействующих с различными аминонокислотными остатками субстрата. Таким образом, становится возможным проанализировать изменения в структуре ферментов, приводящие к различиям в субстратной специфичности. Среди протеаз особый интерес вызывают ферменты с узкой субстратной специфичностью, распознающие, например, только положительно или только отрицательно заряженные остатки. Подобные ферменты нашли широкое применение в современных биомедицинских технологиях, благодаря их способности осуществлять ограниченный гидролиз белков и пептидов. Это делает прогеазы с узкой специфичностью незаменимой составляющей основанных на массспектромегрии протсомных исследований. Такие ферменты применяют для определения первичной структуры и доменной организации, а также идентификации белков. Они могут быть использованы также для сиквенсспецифического гидролиза слитых белков и получения биологически активных пептидов. ГЭПазы в ряду химотрипсинподобных протеаз. Несмотря на то, что I относится к хорошо изученному структурному семейству химотрипсина, а для самого фермента установлена пространственная структура и проведен направленный мутагенез субстратсвязывающего сайта, механизм, определяющий субстратнуЕО специфичность I, как и других глутамилэндопептидаз, неизвестен. Изучение закономерностей, обеспечивающих распознавание отрицательно заряженных остатков субстрата ГЭПазами на примере I, и последующее сравнение с таковыми других ферментов семейства, позволит проанализировать эволюционные изменения, обеспечивающие разнообразие субстратных предпочтений химотрипсинподобных протеаз. Основной целыо данного исследования являлось изучение структурнофункциональных особенностей I, обеспечивающих предпочтение фермента к связям, образованным остатками глутаминовой кислоты. I без концевых аминокислотных остатков и анализ се специфичности. В представленной работе впервые продемонстрировано, что модификация сайта процессинга I влияет на продукцию активного белка клетками В. Впервые исследован механизм созревания рекомбинантной I i vi, и показана необходимость пропептида I для формирования активного фермента. Получен вариант зрелой I с делецией трех концевых аминокислотных остатков, что позволило впервые продемонстрировать важность коицевого района для функционирования фермента. Полученные в работе данные о влиянии модификации сайта процессинга на продукцию активной I могут быть использованы для создания эффективных продуцентов протеаз с узкой субстратной специфичностью. В частности, в работе предложен новый подход к получению 1 в гетерологической экспрсссионной системе, заключающийся в создании автоактивирующегося варианта целевого фермента путем модификации сайта его процессинга.