Иммуноферментный анализ белка, связывающего жирные кислоты на основе рекомбинантных реагентов

• Автор: Андреева, Ирина Петровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2004
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 124 с. : ил.

Кроме того, получение химических конъюгатов часто бывает очень трудоемким и дорогостоящим процессом, так как требует предварительного выделения и очистки как антигена, так и фермента маркера. Поэтому были исследованы альтернативные методы получения конъюгатов. В последнее время все большее распространение получают нехимические методы синтеза конъюгатов белокфермент, основанные на образовании высокоспсцифичекой. Например, для получения конъюгата антител с пероксидазой хрена используют антивидовые антитела к ферменту, которые образуют так называемый иммуноперокендазный комплекс пероксидазаантнтела к пероксидазе, ПАП 1. Еще одним перспективным способом получения конъюгатов является метод с использованием комплекса авидннстрептавидинбиотин, который образуется с Ка М1 7. С развитием генной инженерии появилась возможность создавать рекомбинантные конъюгаты фермента маркера с антителами и белковыми антигенами. Такие конъюгаты обладают рядом преимуществ по сравнению с химически полученными, в частности они гомогенны по составу, имеют стехиометрию, воспроизводимы и достаточно легко получаются 2. Кроме того, рекомбинантные конъюгаты, как правило, сохраняют 0 как ферментативную, так и иммунологическую активность. Генетически сконструированные рекомбинантные конъюгаты получаются с помощью объединения структурных генов антигенаантитела и фермента Рис. УА . Рис. Трансляционный стопкодон на Зконце первого гена и область промотора на 5конце второго гена удаляются и два гена затем лигируются в одной рамке. Оба гена транслируются в один химерный белок 2. Полученный химерный ген кодирует первичную полипептидную цепь, обладающую как антигенной, так и ферментативной активностью. Выход получаемого рекомбинантного конъюгата зависит от ряда различных факторов, таких как выбор экспрессионного вектора, штамма экспрессии и конечной локализации продукта цитоплазма, переплазма или культуральная среда, а также экспрессируется белок в растворимой форме или в телах включения. Промотор 5 УГ
продуцируемого внутриклеточно, н около мгл при продуцировании в переплазму клеток Е. И 2. При экспрессии конъюгат может быть подвергнут протсолити чес кому расщеплению в зависимости от используемого штаммапродуцента. Этот нежелательный протеолиз может, однако, быть лимитирован использованием определенных штаммовпродуцентов, таких как олотрицательные бактериальные штаммы, которые, как было показано, заметно уменьшают протеолиз чужеродных белков 8. На лротеолитнчсскую стабильность конъюгата также может оказывать влияние аминокислотный состав на Ыконце белка и в области линкера. Было показано, что время полужизни белка может варьироваться от пары минут до более чем часов в зависимости от природы аминоконцевого остатка, подтверждая тем самым, что успешная экспрессия чужеродных белков в бактериях зависит от Ыконцевого правила, а именно Иконцевые аргинин, лизин, лейцин, фенилаланин, тирозин и триптофан уменьшают стабильность белка, в то время как другие аминоконцевые аминокислотные остатки значительно увеличивают стабильность того же самого белка 9. Другие сообщения показали, что удаление основных аминокислот в области линкера может защитить рекомбинантный белок от протеолитического расщепления в этой области . На свойства рекомбинантных конъюгатов оказывает влияние структура линкера, разделяющего соответствующие домены бифункционального химерного белка. Проведнные исследования показали, что гибкость и гидрофильность линкера являются основными условиями, позволяющими сохранить функциональную активность связываемых доменов конъюгата . Этот принцип успешно применяется при экспрессии рекомбинантных одноцепочечных антител БсИу, где линкеры нерегулярной структуры способствуют беспрепятственному образованию активных комплексов между вариабельными доменами тяжелой и легкой цепей антитела. Однако, в некоторых работах при использовании гибкого линкера например, С1уегп, п5 наблюдалась потеря функциональной активности одной из составных частей конъюгата связывающая активность белка в в конъюгате с люциферазой, обусловленная по всей видимости возникающим взаимодействием двух субъединиц . В таких случаях необходимо использовать линкеры с жесткой структурой.