Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгенных животных

• Автор: Волкова, Наталья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2008
• Место защиты: Дубровицы
• Количество страниц: 324 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы трансгенсза в животноводстве.

1.1.1. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зигот

1.1.2. Использование ретровирусных векторов

1.1.3. Липосомы как переносчики ДНК

1.1.4. Трансфекция эмбриональных стволовых клеток и получение

трансгенных химер.

1.1.5. Пересадка ядер из трансфецированных соматических клеток

1.1.6. Использование сперматозоидов в качестве переносчиков

чужеродной ДНК
1.2. Применение трансгенных животных.
1.2.1. Трансгенные животные с измененными хозяйственно
ценными признаками
1.2.2. Трансгенные животные биорсакторы
1.2.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для
производства рекомбинантных белков.
1.2.2.2. Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных
животных
1.2.2.3. Использование вирусных векторов для получения трансгенных животных.
1.2.3. Трансгенные животные, генетически устойчивые к инфекционным заболеваниям.
1.2.4. Трансгенные животные как доноры внутренних органов.
1.2.4.1. Проблемы при ксенотрансплантации
1.2.4.2. Экспериментальные наработки в ксенотрансплантации
1.2.4.3. Создание генетически модифицированных доноров
1.2.4.4. Исследования в области ксенотрансплаитации.
1.3. Особенности трансгенсза сельскохозяйственной птицы.
1.3.1. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы
1.3.2. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной
ДНК в эмбриональные клетки и органы птицы
1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.
1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток
ГК для получения трансгенной птицы.
1.3.5. Осеменение самок трансформированными спермиями
1.4. Влияние интегрированных рекомбинантных генов на
гено гии и фенотип трансгенных животных
1.5. Заключение.
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Материалы
2.1.1. Реактивы и оборудование
2.1.2. Животные.
2.2. Работа с культурой клеток
2.2.1. Культивирование клеток.
2.2.2. Получение первичной культуры клеток органов и тканей
животных.
2.2.3. Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы
2.2.4. Трансформация клетокмишеней i vi ретровирусными
векторами
2.2.5. Введение ретровирусных векторов в клеткимишени i
2.2.5.1. Трансформация клеток молочной железы сельскохозяйственных животных
2.2.5.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур
2.3. Анализ наличия генной конструкции.
2.4. Анализ экспрессии рекомбинантных белков.
2.4.1. Иммуноферментный анализ.
2.4.2. Иммуногистохимия
2.4.3. Оценка экспрессии экзогенной ргалактозидазы
2.5. Получение метафазных препаратов хромосом
2.6. Оценка биохимического статуса трансгенных животных
2.7. Проведение гистологических исследований.
2.8. Проведение контрольного откорма трансгенных свиней
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Получение и исследование соматических трансгенных
животных биореакторов
3.1.1. Трансформация клеток молочной железы животных в куль
туре i vi
3.1.2. Создание соматических трансгенных животных и анализ
факторов, влияющих на результативность локального трансгенеза клеток молочной железы животных i viv
3.1.2.1. Оптимизация отдельных элементов технологии локального
трансгенеза клеток молочной железы животных
3.1.2.2. Получение соматических трансгенных животных, продуцирующих с молоком эритропоэтин человека
3.1.2.3. Получение соматических трансгенных животных проду
центов гранулоцитарпого колониестимулирующего фактора человека.
3.1.2.4. Сравнительный анализ эффективности использования рекомбинантных векторов и для транс
формации клеток молочной железы животных i viv.
Влияние проводимых генноинженерных манипуляций на
организм животных
Распространение рекомбинантных векторов в организме
опытных животных.
Сравнительное исследование гистоструктуры вымени и
других органов опытных животных
Изучение трансгенных животных с измененными хозяйственнополезными признаками.
Анализ наследования генной конструкции соматолибсрина
человека в ряде генераций трансгенных свиней.
Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение
стабильности генома трансгенных свиней.
Особенности фенотипа трансгенных свиней
Гормональный статус
Особенности роста и развития.
Мясная продуктивность и качество туш.
Биохимический статус.
Гистологические исследования внутренних органов
Особенности гистогенеза органов и тканей.
Содержание нуклеиновых кислот в клетках различных органов
Анализ корреляций в организме трансгенных свиней и их
аналогов
Изучение трансгенных животных доноров для ксе
нотрансплантации
Анализ наследования рекомбинантной ДНК в ряде генераций кроликов, трансгенных по генам кластера
Анализ экспрессии рекомбинантных генов в организме
трансгенных кроликов.
Влияние интеграции рекомбинантной ДНК на сохранение
стабильности генома трансгенных кроликов
Особенности фенотипа трансгенных кроликов
Биохимический статус.
Морфофункциональная характеристика внутренних органов
Разработка технологии создания трансгенной птицы
Эффективность трансформации эмбриональных клеток кур
ретровирусными векторами в культуре i vi.
Создание трансгенных кур и изучение факторов, влияющих на результативность трансгснсза эмбрионов кур i viv Оптимизация отдельных элементов технологии создания
трансгенной птицы
Введение в эмбрионы кур рекомбинантного вектора
Введение в эмбрионы кур рекомбинантного вектора
Фенотипический эффект экспрессии рекомбинантных генов в организме трансгеиных животных разных форм
в сравнительном аспекте.
Характер наследования генных конструкций в ряде генераций трансгенных животных.
Характер экспрессии рекомбинантных белков в организме
трансгенных животных.
Влияние интеграции и экспрессии чужеродных генов на фенотип трансгенных животных.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
ЛИТЕРАТУРА


При этом способе конструирования образование репликационнокомплемеитарных ретровирусов могло происходить только в случае двух рекомбинаций, что значительно снижало вероятность возникновения данных ретровирусов по сравнению с пакующими линиями первого поколения. Однако при использовании клетокупаковщиц второго поколения в ряде случаев все же диагностировалось образование репликационнокомплемеитарных ретровирусов . Дальнейшие разработки привели к созданию пакующей линий клеток третьего поколения. В данном случае в клеточную линию вводили две транскрипционные единицы, одна из которых содержала ген v, другая гены и . При конструировании первых пакующих линий этого поколения использовали плазмиду помощник, которая соответствовала полному геному вируса дикого типа i, . В связи с этим в этих пакующих линиях также могли образовываться репликационно компетентные ретровирусы Ни . Начиная с х годов, для создания пакующих линий стали применять плазмиду помощник, которая содержала только структурные гены , и v без других ретровирусных последовательностей, и в которой использовался промотор и сигнал полиаденилирования, негомологичные вирусным i . Основные этапы переноса чужеродных генов с помощью ретровирусных векторов. ДНК вектора и селекция, которые осуществляются в клетках . Получение трансгенных животных. Впервые ретровирусные векторы для получения трансгенных животных были использованы в году после инъекции ДНК вируса V присутствие вирусной ДНК было установлено в клетках взрослых мышей i . Несколько позже была доказана интеграция провирусной ДНК V и показана ее передача по наследству i . Позднее было показано, что ретровирусные векторы могут служить хорошей альтернативой для эффективного транспорта генов у сельскохозяйственных животных. В частности, с использованием данных векторов были получены трансгенные коровы , , . Однако инфекцирование зигот или предимплантационных эмбрионов в большинстве случаев приводило к получению трансгенных животиыхмозаиков, что связано с интефацией провирусной ДНК в геном клеткихозяина в период митоза после предварительной репликации ДНК. Учитывая это, с соавторами инфицировали ооциты крупного рогатого скота в метафазе II II второго мейотического деления перед оплодотворением. Все потомки, родившиеся из инфицированных ооцитов, были трансгенными. Не смотря на офаниченное число полученных трансгенных животных, была доказана передача трансгена по наследству и экспрессия рекомбинантного продукта. Другой областью применения ретровирусных векторов является возможность их использования для локальной трансформации отдельных органов и тканей взрослых животных. Особенно это актуально в случае трансформации клеток молочной железы сельскохозяйственных животных с целью синтеза рекомбинантных белков фармакологического назначения в молоко. Эффективность использования ретровирусных векторов для локального трансгенеза клеток молочной железы представлена ниже в разделе 1. Векторами для переноса генных конструкций в эмбриональные линии млекопитающих могут служить и липосомы . Широкому использованию липосом для доставки генов в клетки эукариот способствовал ряд их свойств, а именно способность взаимодействовать электростатически с отрицательно заряженными поверхностями мембран клеток и макромолекулами, а также свойственная им гидрофобность. При этом немаловажную роль в эффективной доставке ДНК шрает размер липосом. В экспериментах i vi было показано, что чем больше размер геносом нм, тем выше эффективность трансфекции, но i viv наблюдалась обратная картина чем меньше был размер липосом нм, тем более эффективно происходила трансфекция клетокмишеней. Липосомы взаимодействуют с клетками путем липидного обмена, адсорбции, слияния и эндоцитоза. Наиболее важным видом взаимодействия является эндоцитоз, когда клетка включает в себя адсорбированные или связанные молекулы в вакуоли эндосомы i . В последние годы достигнут значительный прогресс в конструировании комплексов липосомыДНК, изучены их физикохимические свойства, биологическая безопасность, методы введения и распределения в организме. Однако остается до конца не выясненным вопрос о механизмах проникновения комплексов в ядро клетки, транспорте в цитоплазму, месте деконденсации ДНК .