Липосомальная система доставки антигена вируса ССЯ-76 для пероральной иммунизации птиц

• Автор: Морозова, Юлия Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Санкт-Петербург
• Количество страниц: 226 с. : ил

ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Применение лнпосом в .медицине п ветеринарии

1.1.1. Липосомы, строение, свойства

1.1.2. Способы получения липосом

1.1.3. Деструкция фосфолипидов

1.1.4. Применение липосомальных препаратов

1.2. Синдром снижении яйценоскости.

1.2.1. Определение болезни, распространение, экономический ущерб

1.2.2. Этиология

1.2.3. Эпизоотология болезни

1.2.4. Клинические признаки.
1.2.5. Патологоанатомические изменения
1.2.6. Патогенез заболевания
1.2.7. Диагностика болезни
1.2.8. Специфическая профилактика заболевания.
1.2.9 Принципы конструирования инактивированных противовирусных вакцин
1.3. Псроральная вакцинация.
2. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
3. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Методы работы с вирусом
3.1.1. Культивирование вируса в развивающихся утиных эмбрионах
3.1.2. Культивирование вируса в культуре клеток фибробластов утиных эмбрионов.
3.1.3. Инактивация вируса действием формальдегида.
3.2. Используемые животные н эмбрионы.
3.3. Методы получения липосом.
3.3.1. Получение липосом с использованием ультразвука.
3.3.1. Получение липосом с помощью инертного носителя.
3.4. Используемые методы проведения диагностических исследований
3.5. Определение остаточных количеств органических растворителей хлороформ.
3.6 Определение процента включения антигена ССЯ в липосомм методом разрушения липосом
3.7. Подготовка препаратов липосом к электронномикроскопическому исследованию на ультратонких срезах.
3.8. Приготовление препарата для определения размеров липосом электронномикроскопическим методом
3.8.1. Приготовление препаратов регидратированной субстанции липосомальной вакцины ССЯ для исследования в электронном микроскопе
3.8.2. Подготовка препаратов липосомальной вакцины ССЯ для исследования в электронном микроскопе безводная фиксация
3.8.3. Подготовка липосомальных препаратов для исследования в электронном сканирующем микроскопе
3.9. Определение размера частиц и ФДС сухой липосомальной вакцины против ССЯ оптическим методом
3 Определение остаточной влажности и псрскисного окисления липидов липосомалыюго препарата.
3 Статистическая обработка результатов
4. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
4.1. Методы работы с вирусом ССЯ.
4.1.1. Выбор метода культивирования вируса ССЯ.
4.1.2. Инактивация вируса формальдегидом.
4.2. Изучение пригодности липосомальной формы для получения вакцинных препаратов.
4.2.1. Изучение механизма взаимодействия липосом с клетками фагоцитоз липосом перитонеальными макрофагами.
4.2.2. Исследование физикохимических свойств и биологической активности липосомальной вакцины на модели имитации переваривания i vi
4.2.3. Определение коэффициента включения вируса ССЯ в липосомы
4.2.4. Разработка оптимального ингредиентного состава инактивированной вакцины против ССЯ
4.2.5. Сравнительные экспериментальные исследования стабильности коммерческой и липосомальной форм вакцины против ССЯ из штамма В
4.3. Разработка технологии получения липосомальной сухой вакцины
4.3.1. Разработка методов получения липосом.
4.3.2. Сравнительное изучение липосомальных препаратов из различных фосфолипидов.
4.3.3. Лиофилизация липосомального препарата
4.3.4. Выбор защитной среды.
4.3.5. Интенсификация процесса лиофилизации.
4.3.6 Принципиальная схема получения лнпосомальной сухой вакцины
4.4. Разработка методов контроля лнпосомальной инактивированной сухой вакцины против ССЯ.
4.4.1. Исследование сухой субстанции липосомального препарата.
4.4.2. Определение фосфолипидов, входящих в состав липосом.
4.4.3. Изучение свойств препарата при хранении биологическая активность, остаточная влажность, сыпучесть, перскисное окисление липидов
4.4.4. Определение внутреннего объема липосом методом ЭПР.
4.4.5. Определение фракционнодисперсного состава липосомального препарата ФДС.
4.4.6. Методы контроля лнпосомальной вакцины против ССЯ на стерильность, стабильность реологические свойства, антигенная и иммуногенная активность
4.5. Изучение токсикологни лнпосомальной инактивированной сухой вакцины против ССЯ.
4.6. Исследование свойств инактивированной лнпосомальной вакцины против ССЯ в лабораторных н производственных условиях
4.6.1. Исследование свойств лнпосомальной вакцины в лабораторных условиях.
4.6.2. Проведение производственных испытаний лнпосомальной вакцины
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ.
ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Контактный лизис процесс, который приводит к дестабилизации липосом, находящихся на поверхности клеток. Адгезия механизм, при котором липосомы прикрепляются к определенному участку на клеточной поверхности и остаются без изменений. При попадании липосом в сосудистое русло могут происходить все типы взаимодействия. Они могут происходить на поверхности одной клетки и в зависимости от условий превалировать друг над другом. Основными компонентами для приготовления липосом являются фосфолипиды природного происхождения. Часто применяется фосфатидилхолин ФХ растительного или животного происхождения лецитин, обеспечивающий получение липосом с достаточно высокой емкостью, не обладающих токсичностью и не дающих побочных эффектов при различных способах введения . В качестве дополнительных компонентов используют холестерин, длинноцепочечные углеводородные анионы и катионы. В особых случаях формирование липосом проводят из липидных компонентов эритроцитов, слизистой оболочки желудочнокишечного тракта , микробных фосфолипидов , суммарных фосфолипидов органов мишеней . Фосфолипиды определяют бислойное состояние и стабильность с точки зрения проницаемости для растворов i vi и i viv. Различные температуры фазового перехода, входящих в состав липосом фосфолипидов и присутствие холестерина определяют жесткость мембраны липосом, что является важным фактором, обуславливающим взаимодействие с клетками и позволяющим создавать долгоживущие препараты липосом в крови . Соотношения масс ФХ и холестерина могут колебаться в пределах от до . Двукратное увеличение содержания холестерина в липосомах 1 до практически не влияет на протективные свойства антигспсодержащсго препарата . Присутствие в липосомальной мембране моль холестерина приближает ее физикохимические свойства к природной цитоплазм этической мембране . При введении в липосомы 3 стеариламина или дицетилфосфата, можно получить или положительно, или отрицательно заряженные липосомы ,. Важное значение при получении липосом занимает дисперсионная среда . Оптимальным объемом для получения качественной суспензии липосом является мл на 1 2,5 г липидной пленки , , , , , , . При концентрации липидов свыше мгмл после ультразвуковой обработки наблюдается агрегация липосом. Методы получения липосом классифицируют в соответствии с 3 основными способами их диспергирования, такими как физическое диспергирование, двухфазное диспергирование и детергентная солюбилизация. Благодаря большому количеству методов получения, можно получать липосомы с необходимыми свойствами, в которые можно максимально включить лекарственные вещества и антигены . Рисунок 7 Способы включения веществ липосомы. II присоединение молекул после формирования лнпосом 1 адсорбция за счет гидрофобных участков молекул, 2 встраивание предварительно химически гидрофобизованных молекул, 3 ковалентное связывание с реакционно способной полярной головкой фосфолипида, 4 ковалентное связывание с номощыо бифункционалыи о реагента. Основное различие методов получения заключается в способе, с помощью которого осуществляется диспергирование фосфолипидов в водных средах до возникновения замкнутых липидных везикул. С помощью этого метола фосфолипиды высушиваются на твердой подложке, а затем диспергируются в водной среде. При контакте с водой фосфолипиды набухают и отслаиваясь от подложки образуют замкнутые мультиламеллярные липосомы. Одним из методов механического диспергирования является метод, в котором фосфолипиды высушиваются на подложках из хлористого натрия или сорбита. При добавлении воды к высушенному фосфолипиду, который покрывает частицы подложки, образуя так называемые пролипосомы, подложка быстро растворяется, липид набухая образует замкнутые мультиламеллярные липосомы. Из пролипосом происходит быстрое образование однородных по размерам липосом. Этот метод очень полезен при промышленном производстве липосом, т. После приготовления липосом, для улучшения их свойств обычно пользуются следующими технологиями обработка ультразвуком , использование микроэмульгаторов , лиофильное высушивание , замораживание оттаивание , , распылительная сушка , .