Формирование изомеров металлопротеиназы Thermoactinomyces sp. 27a при про-зависимом фолдинге

• Автор: Сафина, Дина Рашидовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 104 с. : ил.

ВВЕДЕНИЕ

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Прозависимый фолдннг белков

1.1.1. Прозавнснмы фолдинг протеолитических ферментов

1.2. Термолизинподобные металлопротеиназы

1.2.1. Струюуриофупкциоиальная организация термолизинподобных металлопротеиназ бацилл

1.2.2. Организация активного центра молекулы термолизина

1.2.3. Организация субстратсвязывающего кармана

1.2.4. Организация сайтов связывания ионов кальция

1.2.5. Пропослсдоватслыюсти термолизинподобных металлопротеиназ

1.3. Термолизинподобная металлонротеиназа

ТИеппоаМтотусез Бр. а
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЕДОВАНИЯ
2.1. Микробные штаммы и плазмиды
2.2. Культивирование микрооргштзмов
2.3. Выделение плазмидиой ДНК
2.4. Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот .
2.5. Ферментативный гидролиз
2.6. Полимеразная цепная реакция
2.7. Получение конструкций, обеспечивающих экспрессию
модифицированных генов металлопротеиназ в клетках штамма i ii
2.8. Обработка амплификацноиных фрагментов полинуклеотидкиназой
2.9. Трансформация клеток i ii
2 Трансформация клеток ii i штаммы X1 и
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК
2 Анализ динамики накопления протеолитических ферментов в культуральной жидкости штаммовпродуцеитов В. ii
2 Анализ динамики накопления целевых белков в клетках . i ,
несущих экспрсссионные плазмиды
2 Экстракция нерастворимых целевых белков из мембранных фракций
рекомбинантных штаммовпродуцентов, несущих экспресснонныс плазмиды
2 Очистка целевых белков из биомассы штаммовпродуцентов, несущих
экспрсссионные плазмиды
2 Очистка металлопротеиназы на аффинном сорбенте
2 Электрофоретический анализ белков
2 Количественное определение белка
2 Фолдинг в системе i i
2 Фолдинг в системе i
2 Определение протеолитической активности ферментов
2 Влияние температуры на стабильность фермента .
2 Статистическая обработка данных .
2 Представление молекул
2 Компьютерный анализ результатов элсктрофорсзов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Характеристика металлопротеиназы i . а
3.2. Конструирование мутантных вариантов металлопротеиназы
i . а, с делетированной дополнительной Сконцевой последовательностью
3.3. Характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы
i . а.
3.4. Конструирование изолированных фрагментов металлопротеиназы
i . а
3.5. Биосинтез мутантных вариантов металлопротеиназ i . а, В. vi, В. ii
в клетках . i
3.6. Анализ внутри клеточной локализации модифицированных
вариантов металлопротеиназ в клетках . i .
3.7. Очистка изолированных частей металлопротеиназ i . и В. ii .
3.8. Фолдинг металлопротеииазы i . а
3.9. Фолдинг металлопротеииазы i . а в присутствии чужеродной пропослсдоватсльности
ЗЛО. Очистка вариантов металлопротеииазы i . а,
полученных при проведении фоддинга в системах i и i I
3 Характеристика металлопротеиназ i . а,
реактивированных в системах i i и i
ВЫВОДЫ .
БЛАГОДАРНОСТИ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Широкое применение в современной биотехнологии получили протеолитичсские ферменты в частности, продуцируемые микроорганизмами, обитающими в уникальных природных и искусственных экосистемах, которые являются перспективными для практического использования, а также весьма интересными с научной точки зрения. Так одним из интригующих и мало изученных вопросов является механизм образования ферментами корректной пространственной структуры, а так же способность на базе одной и той же аминокислотной последовательности формировать функциональноактивные белковые молекулы с различными свойствами. Данная работа посвящена изучению возможности образования функционально различающихся изомеров протеолитических ферментов в ходе прозависимого фолдинга на модели термолизинподобной металлопротениазы ii . Работа поддержана грантами РФФИ 0, 1, 5. Цель работы. Целью данной работы являлось выяснение возможности конструирования различающихся по специфичности действия протеолитических ферментов на базе единой аминокислотной последовательности без внесения замен в функционально существенные области молекулы. Научная новизна. Впервые сконструированы разнообразные модифицированные варианты гена металлопротеиназы i . Показано, что данный фермент формирует свою пространственную структуру по прозависимому механизму и продемонстрирована возможность получения стабильных, отличных по своей субстратной специфичности, протеиназ на базе одной аминокислотной последовательности. Практическая значимость. Полученные результаты открывают новый подход для конструирования протеолитических ферментов с модифицированными свойствами, в частности, измененной субстратной специфичностью. Поскольку протенназы занимают лидирующее месго среди ферментов, используемых в практических целях, то этот подход может быть использован при оптимизации целого ряда биотехнологических производств. Положения, выносимые на защизу. Конструирование и характеристика модифицированных вариантов металлопротеиназы i . Доказательство протекания фолдинга металлопротеиназы i . Изучение возможности использования гегерологичных пропоследовательностей в качестве фолдингассистентов. Конструирование на базе одной полипептидной цепи протеолитических ферментов, отличающихся по своей субстратной специфичности. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 1. Особенностью некоторых прокариотических и эукариотических белков является то, что первоначально они синтезируются в виде лишенных активности предшественников прспроферментов. К настоящему времени известно, что пререгион, как правило, обеспечивает транспорт белка через плазматическую мембрану 1. Роль же лропоследовательности, в большинстве случаев, до конца не установлена и активно обсуждается. При этом особенностью многих белков является то, что они не способны формировать функционально активных молекул в отсутствии их пропоследовательностей. Предполагается, что в таких случаях, именно пропептиды задействованы в формировании корректных пространственных структур ассоциированных с ними белковых молекул. Такое явление получило название прозависимого фолдинга, а участвующие в нем пропептнды внутримолекулярных шапероиов ВМШ 2. I класс составляют пропоследовательности, которые функционируют, как внутримолекулярные шапероны и непосредственно катализируют реакцию фолдинга. Сюда относят пропептиды таких белков, как, например, алитичсская протеаза, аквализин I, карбоксипептидаза , сериновая протеиназа i , субтилизшг, термолизин, трансформирующий фактор роста, фактор Виллибранда, фактор роста нервов, фурии, химопапаин, щелочная эластаза , эластаза, i, инсулин и др. II класс составляют пропептиды, выполняющие другие функции, такие как, например, белковый транспорт, олигомеризация и для которых характерно только непрямое вовлечение в фолдинг белков. Это, например, пропоследовательности барназы, бычьего панкреатического ингибитора трипсина, катепсина , коллагена, протромбина, соматостатнна и др. В дальнейшем, в представленном обзоре будут рассматриваться пропоследовательности I класса па моделях протеолитических ферментов различных групп.