Плазмидные ДНК со вставкой гена ангиогенина как потенциальные инструменты для генотерапии

• Автор: Дударев, Алексей Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Новосибирск
• Количество страниц: 105 с. : ил

Введение

Глава I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Новые подходы в гемотерапии. Рекомбинантные ДНК как инструменты переноса генов и потенциальные лекарственные
ф препараты

1.1.1. реимущества и недостатки молекулярных структур, переносящих гены

1.1.2. Терапевтический ангиогенез как часть гемотерапии

1.2. Ангиогенез

1.2.1. Ангиогенин и его роль в ангиогенезе функциональная активность,

генетическая и белковая структура

1.2.2. Гомеобоксные гены белковых ростовых факторов и регуляторная

роль их белков в процессах морфогенеза и ангиогенеза

1.3. Ранний постнатальный онтогенез как чувствительная модель для
генотерапевтических воздействий переноса клонированных генов
1.4. Биореакторы в современной микробиологии и биотехнологии
сравнительный аспект
1.5. Теоретическое обоснование процесса вихревого принципа
ферментации
1.5. Заключение но обзору литературы
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Реагенты, реактивы и оборудование
2.2. Ферменты
2.3. Буферные системы и среды
2.4. Бактериальные штаммы
2.5. Плазмиды, содержащие промоторы генов млекопитающих, как
системы доставки и временного увеличения дозы гена
2.6. Методы
2.6.1. Методика трансформации рекомбинантных плазмид в штамм .i
2.6.2. Метод наработки бактерий . i, трансформированных рекДНК, в газовихревых биореакторах Биок
2.6.3. Аналитический метод выделения рекДНК
2.6.4. Методика тестирования препаратов рекомбинантной ДНК, содержащих клонированный ген ангиогенина человека, на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов X РКЭ
2.6.5. Методика введения биопрепаратов в организм новорожденных мышей линии
Глава. 3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
3.1. Изучение параметров получения полупрепаративных количеств биомассы . i, содержащей рекомбинантные плазмиды, в газовихревых реакторах Биок
3.2. Отработка методов получения из полупрепаративных количеств биомассы . i рекомбинантных ДНК, обладающих ангиогенным эффектом
3.3. Результаты тестирования препаратов клонированного гена ангиогенина человека на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов ХАО РКЭ
3.4. Экспериментальные данные о влиянии рекомбинантной ДНК со вставкой гена ангиогенина на ранний постнатальный онтогенез мышей линии
Глава 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Заключение
Список литературы
СПИСОК ПРИНЯТЫХ СОКРАЩЕНИЙ
АНГ
ДНКаза
кДНК
МАО А
РГГР
РекДНК
РНКаза
РНКазин
СС
ФРФ
ФРГ
ХАО РКЭ
кЬ
ангиогенез
ангиогенин
генотерапия
дезоксирибонуклеаза
ишемическая болезнь сердца
ДНК, комплементарная матричной РНК
моноаминооксидаза А участвует в распаде серотонина
моноклональные антитела
рилизинггормон гормона роста стимулятор гормона роста рекомбинантная ДНК рибонуклеаза ингибитор РНКаз соматотропин гормон роста соматостатин ингибитор гормона роста трансформирующий фактор роста фактор роста фибробластов фактор роста сосудистого эндотелия фактор роста гепатоцитов фактор некроза опухоли хориоаллантоисная мембрана развивающихся куриных эмбрионов пары оснований тысяча пар оснований
ВВЕДЕНИЕ


В дальнейшем мы предполагали модифицировать щелочную методику выделения ДНК и литиевую доочистку ДНК Мазин и др. Таким образом, мы предполагали получать очищенные препараты рекДНК в больших количествах на низкоскоростных, но крупногабаритных центрифугах. Таким образом, весь процесс от создания генетических конструкций до испытания их активности можно было бы вести в одном специализированном исследовательском центре, в котором будут соблюдаться необходимые стандарты и условия стерильности. Во взрослом организме ангиогенез в норме практически отсутствует по причине реализации в тканях регулирующего онтогенез механизма Мертвецов, Стефанович. Мы учитывали, что генотерапевтические конструкции плазмид, несущие клонированные гены в том числе ген ангиогенина успешно функционируют в эукариотических организмах и используются для лечения заболеваний, связанных с необходимостью временною увеличения дозы гена в органах и тканях. Механизм экспрессии таких плазмид в организме, причину их непродолжительного существования там, а также место локализации клеточное ядро или цитоплазма установить пока не удатся. Плазмиды не содержат в своем составе генов, кодирующих вирусные белки, и поэтому более безопасны. По той же причине они не защищены от действия нуклеаз клеток и плазмы организма. Тем не менее, они функционируют в тканях млекопитающих Баранов, Баранов . Ядерная локализация генов ангиогенина и других ангиогенных белковых факторов предполагает регуляторную роль таких белков в ходе онтогенеза . Нами было решено разработать эксперимент на новорожденных мышах с целью испытать определнную генноинженерную конструкцию на предмет возможной трансформации и последующей экспрессии в развивающемся организме мышей. Целью диссертационной работы являлась разработка методов для препаративной наработки, очистки и тестирования генотерапевтических генноинженерных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенных ростовых факторов человека. Отработка метода получения биомассы бактерий . ДНК, с клонированными генами млекопитающих в газовихревых биореакторах Биок. Наработка и очистка экспериментальных полупрспарагивных количеств рекомбинантных ДНК, предназначенных для экспериментов в области генотераиии. Тестирование активности генноинженерных плазмидных конструкций, содержащих клонированные гены ангиогенина человека на модели хориоаллантоисной мембраны развивающихся куриных эмбрионов ХАО РКЭ и в раннем постиатальном онтогенезе линейных мышей. Исследование возможности разработки оригинальной схемы для переноса клонированных генов в постиатальном онтогенезе линейных мышей. Создана система культивирования в газовихрсвых биореакторах Биок для наработки биомассы бактерий . ДНК, а также выделения из неб рскДНК с клонированными нами человека. Разработана оригинальная схема эксперимента по переносу генов, заключнных в рекомбинантных плазмидных конструкциях, в раннем постнатальном онтогенезе мышей для генотерапевтических воздействий. ДНК для использования в генотсрапии. Разработанная схема переноса клонированных генов в раннем постнатальном онтогенезе мышей представляет практическую ценность для реализации генотерапевтических конструкций в тканях млекопитающих. ДНК ангиогенина человека. Модифицирована и апробирована методика выделения, очистки и хранения полупрепаративных количеств рекомбинантных плазмидных ДНК, нарабатываемых в газовихревом биореакторе Биок. Тестирование рекомбинантных плазмидных ДИК, содержащих ген ангиогенина человека на хориоаллантоисной мембране развивающихся куриных эмбрионов ХАО РКЭ, свидетельствует об их биологической активности. Генноинженерные конструкции, введнные мышам на второй день после рождения голая рекомбинантная ДНК, содержащая клонированный ген ангиогенина человека, влияют на постнатальный онтогенез мышей линии 8, значительно тормозя их рост с по день послеутробного развития. Период раннего постнатального онтогенеза вторые сутки показал себя чувствительным к влиянию рекомбинантной ДНК ангиогенина человека. Таким образом, впервые отработана схема переноса генов плазмидных рекДНК в ткани млекопитающих в раннем постнатальном онтогенезе.