Частота интеграции генно-инженерных конструкций при различных способах введения их в эмбрионы

• Автор: Шишиморова, Мария Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2003
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 121 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ
Введение.

1 .Обзор литературы

1.1 Современные достижения и перспективы развития генноинженерных

технологий

1.2. Основные способы введения генноинженерных конструкций в эмбрионы животных

1.3. Основные направления исследований по получению трансгенных жи

вотных.

1.4. Эффективность интеграции чужеродных генов в геном животных.

2. Объекты и методы исследований

2.1. Материалы и объекты исследований.

2.2. Получение и хранение культуральной среды, содержащей ретровирусные конструкции
2.3. Получение мышиных эмбрионов
2.4. Микроинъекция различных генноинженерных конструкций
2.5. Культивирование мышиных эмбрионов i vi
2.6. Трансплантация зародышей псевдобеременным реципиентам.
2.7. Определение интеграции трансгена с помощью ПЦРанализа на стадии эмбриона.
2.8. Определение интеграции трансгсна в геном рожденного потомства
3. Результаты собственных исследований
3.1. Влияние микроинъекции в пронуклеусы мышиных зигот плазмидной конструкции совместно с рестриктазой на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном хозяина .
3.1.1. Влияние совместной микроинъекции плазмидной генноинженерной конструкции с рестриктазой i на жизнеспособность мышиных эмбрионов и частоту интеграции трансгена, определенную на стадии бластоцисты.
3.1.2. Приживляемость зигот, микроинъецированных генной конструкцией совместно с рестриктазой i в концентрации 0, едмкл, и интеграция трансгена в геном рожденного потомства.
3.2. Влияние микроинъекции в перивителлиновое пространство зигот разных вариантов культуральной среды, содержащей генноинженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и частоту интеграции трансгена в геном мышей.
3.2.1. Влияние инъекции в перивителлиновое пространство зигот разных вариантов культуральной среды, содержащей генноинженерную конструкцию I встроенную в ретровирусный вектор, на развитие эмбрионов i vi и частоту интеграции трансгена в геном бластоцист.
3.2.2. Приживляемость эмбрионов, развившихся из зигот, микроинъецированных генной конструкцией , встроенной в ретровирусный вектор,
и интефация трансгена в геном рожденных мышей.
3.3. Влияние различных способов микроинъекции в зиготы мышей генноинженерной конструкций, встроенной в ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и интеграцию трансгена в геном хозяина на разных стадиях развития .
3.3.1. Жизнеспособность мышиных зигот и частота интсфадии трансгена, определенная на стадии бластоцисты, при различных вариантах микроинъекции среды, содержащей ретровирусный вектор
3.3.2. Влияние разных способов инъекции ретровирусной конструкции в зиготы мышей на приживляемость эмбрионов и интефацшо трансгена в геном полученного приплода.
Обсуждение полу ченных результатов
Выводы.
Практические предложения.
Список литературы


Результаты исследований, направленных на изучение влияния генноинженерных конструкций, встроенных ретровирусный вектор, на жизнеспособность эмбрионов и на частоту интеграции трансгена в геном рожденного потомства могут быть использованы в работах по получению как лабораторных, так и сельскохозяйственных трансгенных животных и существенно повысить общую эффективность технологии трансгеноза. Результаты исследований, полученные в экспериментах по совместному введению в пронуклеусы зигот рестриктазы i с генноинженерной конструкцией могут быть использованы для повышения частоты интеграции трансгена в геном животных. Данные по развитию мышиных зародышей после различных биотехнологических манипуляций могут быть использованы при проведении исследований в области экспериментальной эмбриологии млекопитающих. Микроинъекция в перивителлиновое пространство зигот генноинженерных конструкций, встроенных в ретровирусный вектор, способствует увеличению частоты интеграции трансгена в геном эмбрионов и рожденного потомства, по сравнению с введением плазмидных конструкций в пронуклеусы зигот. Микроинъекция в цитоплазму зигот культуральной среды, содержащей генноинженерную конструкцию, встроенную в ретровирусный вектор, в значительной степени повышает интеграцию трансгена в геном эмбрионов, однако снижает их приживляемость в организме самокреципиентов. Рестриктаза i в концентрации 0,ед. Основным фактором, снижающим жизнеспособность зигот, инъецированных средой, содержащей ретровирусы дефектные по репликации, является присутствие в инъекционной фрагментов разрушенных клетокупаковшиц. Результаты исследований последних десятилетий в области эмбрио и генной инженерии дают принципиальную возможность генетического совершенствования животных путем прямого переноса в их геном рекомбинантных чужеродных генов. Успехи, достигнутые в области генетической трансформации соматических клеток животных, способствовали проведению опытов по введению чужеродных генов в эмбрионы млекопитающих с целью изменения их генотипа на уровне целого организма. Развитие исследований в области трансгеноза на животных началось с момента проведения эксперимента по переносу генноинженерных конструкций в зиготы мышей в году . Позитивные результаты проведенных экспериментов показали возможность введения рекомбинантных генов в геном сельскохозяйственных животных, и стимулировали развитие работ в этом направлении . V, . В настоящее время появилось большое число публикаций по генетической трансформации как лабораторных, так и сельскохозяйственных животных i . I., . Разработка и совершенствование эффективных биоинженерных технологий открывает перспективы получения трансгенных животных с генетически улучшенным потенциалом продуктивности, с устойчивой резистентностью к различным инфекционным заболеваниям, с измененными технологическими свойствами молока, а также животных продуцирующих с молоком или кровью биологически активные вещества , i . На сегодняшний день с помощью биоинженерных технологий получено достаточное количество трансгенных сельскохозяйственных животных. К настоящему времени благодаря генной инженерии были получены трансгенные овцы с интегрированным геном антитрипсина человека под промотором гена лактоглобулина овец с достаточно высоким уровнем экспрессии чужеродного гена. Продукция рекомбинантного белка в молоке составила гл i . Наряду с сообщением о трансгенных овцах были опубликованы данные о получении трансгенных коз с индуцированным геном плазминогенного активатора ткани человека под промотором кислого сывороточного белка мыши, где уровень экспрессии гена плазминогенного активатора в молоке коз составил Змкгмл . Группой немецких ученых были получены трансгенные кролики, продуцирующие с молоком человеческий интерлейкин 2 Т . Также сообщалось о получении трансгенных кроликов с разными интегрированными рекомбинантными последовательностями с геном прохимозина под промотором Iказеина КРС, с геном инсулиноподобного фактора роста человека 1 1 . Животные продуцировали с молоком до 1мгмл рекомбинантного белка , i V . Опубликованы данные о получении трансгенного крупного рогатого скота, со встроенным геном лактоферрина человека под контролем регуляторной последовательности казеина КРС. Уровень экспрессии чужеродного гена в молоке трансгенных животных составил 0,8 гл i v .