Изучение интеграции, наследования и экспрессии рекомбинантных генов с молоком кроликов

• Автор: Елагин, Владимир Викторович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: п. Горки Ленинские, Московской обл.
• Количество страниц: 149 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
1. Введение

2. Обзор литературы

2.1. Методы создания трансгенных животных

2.1.1. Перенос генов посредством микроинъекции ДНК.

2.1.2. Использование ретровирусных векторов.

2.1.3. Пересадка ядер трансфецированных генами

2.1.4. Использование половых клеток семенников

2.2. Экспрессия генов.

2.2.1. Экспрессия в кровь

2.2.2. Экспрессия в молоко

2.3. Области применения транспорта генов
2.3.1. Рост и развитие животных.
2.3.2. Получение молока с желаемыми свойствами
2.3.3. Повышение качества и выхода шерсти у овец
2.3.4. Повышение устойчивости сельскохозяйственных животных к инфекционным заболеваниям.
2.3.5. Биологическое моделирование
патологических состояний человека.
2.3.6. Создание трансгенных животных доноров органов для
трансплантации человеку.
2.4. Выбор вида для получения трансгенных животных
2.4.1. Кролики, как продуценты рекомбинантных белков.
2.4.1.1. Молочность крольчих
2.4.2. Кролик, как продуцент гранулоцитарного
колониестимулирующего фактора ГКСФ.
2.4.3. Биология и методы применения
тканевого плазминогенного активатора
3. Материалы и методы исследования
3.1. Объекты исследования.
3.2. Генные конструкции.
3.3. Подбор доноров и реципиентов.
3.4. Схема гормональной подготовки доноров
3.5. Синхронизация овуляции у реципиентов.
3.6. Методика извлечения зигот у кроликов.
3.7. Оценка полученных эмбрионов и микроинъекция гена.
3.8. Пересадка микроинъецированных эмбрионов
3.9. Получение и выращивание крольчат.
3 Размножение трансгенных кроликов.
3 Молекулярногенетический анализ
3 Доение и сбор молока.
3 Методика определения биологической активности ГКСФ.
3 Иммуноферментный анализ
4. Результаты
4.1. Влияние микроинъекции гена на развитие эмбрионов кролика
4.2. Изучение эффективности получения трансгенных
кроликов путем микроинъецирования ТПА в зиготу..
4.3. Наследование трансгена
4.3.1. Наследование гена ТПА у потомков первого поколения
4.3.2. Наследование гена гранулоцитарного
колониестимулирующего фактора ГКСФ.
4.4. Разработка оптимального режима доения.
4.5. Молочность трансгенных крольчих.
4.6. Определение биологической активности ГКСФ
в молоке грансгенных крольчих
4.7. Уровень содержания ГКСФ в молоке трансгенных кроликов.
4.8. Исследование крови трансгенных кроликов
4.9. Изучение динамики роста и развития трансгенных кроликов
5. Обсуждение.
6. Выводы.
7. Практические предложения.
Список литературы


ДНК происходит значительно чаше, чем кольцевых суперспирализированяых молекул i . . . Было замечено, что большое значение для экспрессии играет то, какая ДНК используется дя микроинъекции геномного происхождения или содержащая один или несколько интронов кДНК. Геномная ДНК экспрессируется в 0 раз более эффективно, чем кДНК трансген i . . , i Т. ii . . . Однако имеются данные о том, что использование кДНК так же позволяет достигнуть высокого уровня экспрессии. Так, . ДНК конструкции гена инсулиноподобного фактора роста1 человека I1 получили уровень экспрессии гетерогенного протеина в молоке трансгенных кроликов 0,51 гл. Повысить зависимый от числа интегрировавшихся генов и тканеспецифичности уровень экспрессии инъецируемых генов позволяет дополнение генной конструкции i . У доноров по разработанному для каждого отдельного вида животных способу вызывают суперовуляцию, после чего их дважды искусственно осеменяют или спаривают. В зависимости от вида животных промывание яйцеводов выполняют у живых доноров под наркозом посредством хирургического вмешательства или после забоя Брем и др. Самок кроликов шесть раз подкожно инъецируют фолликулостимулирующим гормоном , ii, V по 0,5 мл с часовым интервалом, а затем Ед хорионического гонадотропина через часов после последнего введения . Спаривают крольчих с самцами через 1 час после инъекции . Эмбрионы собирают вымыванием из яйцеводов средой М2 через час после обработки i . Свиньям вводят ГСЖК и через часа 0 ХГ. На четвертые сутки дважды, с интервалом в часов, искусственно осеменяют, а извлечение эмбрионов проводят спустя 25 часов после инъекции ГСЖК Ьрсм и др. Аналогичными методиками пользуются при получении эмбрионов у мышей, мелкого и крупного рогатого скота. У овец и коз нехирургический метод извлечения и пересадки эмбрионов, который широко применяется у крупного рогатого скота невозможен ввиду трудности прохождения катетера через шейку в рога матки, но хирургическая операция у этих видов животных относительно проста и непродолжительна. Однако в настоящее время в качестве нехирургического метода извлечения и пересадки эмбрионов применяется эндоскопический метод, который более эффективен, чем хирургический. Незрелые ооциты коров могут быть получены из яичников овариоэктомией отсасывают из фолликулов размером 15 мм или при убое коров. Если корову стимулируют , то число ооцитов на донора колеблется обычно от 5 до . Ооциты с компактным кумулюсом культивируют часа и осеменяют замороженнооттаявшей спермой Эрнст Л. К., Прокофьев М. И., . Как показано в таблице 1, проиуклеусы отдельных видов трудно визуализировать оптикой Номарского. У свиней и коров цитоплазма в эмбрионах затемняется включениями липидов, и поэтому пронуклеусы не видны. В , . Процедура в дальнейшем была адаптирована дтя эмбрионов жвачных животных. Она позволяет визуализировать большинство пронуклсусов без серьезных препятствий для выживания эмбрионов. У овец и коз пронуклеусы могут быть визуализированы оптикой Номарского, однако, некоторые исследователи предпочитают центрифугировать эмбрионы, чтобы улучшить прозрачность цитоплазмы . ., . Обобщенные данные, относящиеся к сбору, визуализации, пригодности к микроинъекции и пересадки микроинъецированных эмбрионов представлены в таблице 1. Эффективность получения, качество и пригодность эмбрионов отдельных видов, используемых для микроипъекций в трансгенезе по . . . Корова 1 2Зд Нет8 Оч. Вгеш в а1. Отдельные исследователи для пересадки эмбрионов используют лапароскопию, в то время как остальные все еще используют хирургическую лапаротомию для пересадки микроинъецированных эмбрионов. Указывается количество одноклеточных эмбрионов, полученных через 1УМ1УР фолликулярных ооцитов из одного яичника. Это число колеблется между группами, в зависимости от качества яичников, и пригодности адекватных фолликулов, среди других факторов.