Разработка технологии выделения и очистки трансэлиминаз Bacillus macerans и изучение их свойств

• Автор: Ежова, Анна Юрьевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 162 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Пектиновые вещества.

1.2. Пектолитические ферменты.

1.2.1. Пектинэстеразы.

1.2 2 Полигалактуроназы.

1.2.3. Лиазы, расщепляющие пектиновые вещества

1.3. Выделение и очистка пектолитических ферментов

1.4. Применение пектолитических ферментов.

ГЛАВА 2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

2.1. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1.1. Методы выделения и очистки ферментов.
2.1.2. Методы определения активности ферментов
2.1.3. Методы определения белка, углеводов, влажности, зольности,
2 .1.4. Изучение степени чистоты препарата
2.1.5. Определение молекулярной массы.
2.1.6. Определение изозлектрической точки исследуемых белков.
2.1.7. Определение аминокислотного состава
2.1.8. Определение оптимальных условий действия и стабильности ферментов.
2.1.9. Изучение влияния различных реагентов на активность ферментов
2.1 Изучение субстратной специфичности ферментов
2.1 Определение кинетических констант гидролиза субстратов.
2.1 Определение мацерирующей способности ферментов
2.2. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИИ И ОБСУЖДЕНИЕ.
2.2.1. Выделение пектолитических ферментов из культуральной
жидкости i
2.2.1.1. Изучение стабильности трансэлиминазы в культуральной жидкости i
2.2.1.2.Изменив условий отделения культуральной жидкости В.
от биомассы.
2.2.1.3. Исследование процесса концентрирования ферментного раствора методом ультрафильтрации
2.2.1.4. Характеристика базового ферментного препарата Фитолиаза
2.2.2. Исследование методов получения гомогеных трансэлиминаз В.
.
2.2.2.1. Выбор условий предварительной очистки ферментов
2.2 2.2. Исследование условий хроматографической очистки и
разделения ферментов
2.2.2.3. Применение метода гельфильтрации для разделения и очистки трансэлиминаз.
2.2.3.Изучение степени чистоты высокоочищенных препаратов ферментов из В..
2.2.4. Изучение специфичности действия ферментов.
2.2.5. Изучение физикохимических свойств пектинлиазы и пектатлиазы
2.2.6. Изучение строения гомогенных ферментов
2.2.7. Определение мацерирующей способности фермен тов.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Результаты исследований пектина, которые провели Альберсхейм и Вораген , 0 показали, что дайна боковых цепей может колебаться от одного до и более гликозидных остатков. Структура и характер пектиновых веществ определяют пространственную форму их молекул и характер взаимодействия с друг ими соединениями. Молекулярная масса пектинов, выделенных из различных объектов, изменяется в пределах от 0 до 0 0 . В природе пектиновые полисахариды встречаются в основном в виде водонерастворимого протопектина. Растворимый пектин и протопектин локализованы в разных частях растительной клетки и выполняют различные функции. Протопектин входит в состав клеточной оболочки, из него в значительной степени состоят срединные пластинки растворимый пектин находится в соке вакуоли и межклеточных слоях ткани зрелых плодов. Большое количество пектиновых веществ содержится в молодой, активно растущей ткани. Так, в незрелых фруктах большая часть пектиновых веществ представлена в виде протопектина, который в течение созревания и дозревания трансформируется в растворимый пектин . У сахарной свеклы напротив, в созревающих корнеплодах накапливается протопектин . Химическое строение молекулы протопектина до настоящего времени до конца не установлено, так как выделить нативный протопектин в чистом виде пока не удалось. Пектиновые полисахариды растворимы в воде и других растворителях, например ди метил сульфоксиде и горячем глицерине, и не растворимы в спирте и ряде других органических растворителях. Водные растворы пектинов обладают высокой вязкостью, которая зависит от их молекулярной массы, степени этерификации, ионной силы, , температуры и концентрации , . Множество необычных свойств пектиновых полисахаридов определяется наличием карбоксильных групп в остатке галактуроиовой кислоты. При полной химической этерификации пектина изменяются его кислотность, вязкость и гелеобразующие свойства, причем изменения не оказывают большого влияния на вязкость полностью этерифицированных пектинов. Однако оказывает ощутимое влияние на вязкость низкоэтерифицированных пектинов и пектиновой кислоты . При ниже 4 между молекулами возникают связи, вязкость возрастает и происходит осаждение пектиновых веществ. Важным физическим свойством пектиновых веществ, определяющим широкую область их применения в пищевой промышленности, является способность образовывать гели в присутствии сахара, кислоты и под действием поливалентных ионов металлов . Пектиновые вещества имеют более слабые водородные связи, чем целлюлоза, их разрыв ведет к ослаблению межклеточных соединений, т. Процесс распада межклеточных веществ, состоящих в основном из протопектина, носит название мацерации растительных тканей и приводит в результате к разделению клеток 5. Приведенный анализ литературы свидетельствует о том, что пектиновые вещества, структура которых до конца не изучена, являются сложным субстратом, атакуемость которого ферментами весьма непредсказуема. Поскольку пектиновые полисахариды повсеместно распространены в растениях, следовательно, существуют ферментные системы, способные расщеплять эти биополимеры. Пектолитические ферменты распространены чрезвычайно широко, они синтезируются высшими растениями, микроскопическими грибами, бактериями и некоторыми видами дрожжей , . Изучение пектолитических ферментов имеет большое практическое значение, так как их воздействие на пектиновые вещества лежит в основе многих технологических процессов в пищевой и медицинской промышленности, а также в сельском хозяйстве. В г. Кертсц впервые осветил состояние вопроса о пектолитических ферментах. По результатам исследований он предположил существование трех ферментов пектолитического комплекса, которые различаются по механизму действия. Эго протопектиназа, катализирующая превращение протопектина в пектин растворимый, пектаза, отщепляющая метоксильные группы в молекуле пектина, и пектиназа, гидролизующая а1,4 связи полигалактуроновой цепочки. В г. Демейн и Фафф сделали первую попытку классифицировать ферменты этой группы, положив в основу принципы разделения пектолитических ферментов, предложенные Кертецом.