Разработка технологии биосинтеза АТФ с помощью иммобилизованных клеток дрожжей Saccharomyces cerevisiae SL-100

• Автор: Фомин, Андрей Андреевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 160 с. : ил.

1.1 Способы получении аденозинфосфатов

1.2 Ьиотрансформации аденозини до аденозинфосфатов

1.3 Механизмы биотрансформации аденозипа до аденозинфосфатов.

1.4 Факторы, определяющие характер и степень биотрансформанни аденозини в аденозинфосфаты.

1.5 Состав и структура клеточных мембран

1.6 Примеры использования микроорганизмов с измененной клеточной проницаемостью.

1.7 Механизм воздействия толуола на клеточные мембраны

1.8 Степень воздействия толуола на микроорганизмы.

1.9 Практическое применение биозрансформации аденозипа до аденозинфосфатов

1. Использование иммобилизованных клеток для

проведения биотрансформаций.

II. Материалы и методы
III. Экспериментальная часть
3.1 Методы повышения проницаемое й клеточных мембран
3.2 Фосфорнлированис на уровне субстрата
3.3 Определение оптимального времени воздействия толуола на клетки дрожжей рода vii при иогрансформацин аденозипа до аденозинфосфатов.
3.4 Оценка жизнеспособности клет ок дрожжей, обработанных толуолом.
3.5 Изучение кинетики роста клеток дрожжей vii, обработанных различными концентрациями толуола.
3. Кинетические характеристики роста клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола на начальной стадии роста.
3. Кинетические характеристики i клеток дрожжей, подвергнутых воздействию толуола в активной фазе роста.
3.6 Изучение фермен тативной активност и клеток дрожжей, обработанных различными концентрациями толуола.
3.7 Определение степени влияния воздействия толуола на ферментные сист емы дрожжей.
3.8 Оценка способности к самовоснронзводетву клеток дрожжей vii, после возденетвня па них толуола.
3.9 Бнотрансформання аденознна в АТФ, АДФ и АМФ дрожжами vii 0 в процессе нх роста.
3. Биотрансформация аденознна в АТФ, АДФ и АМФ клетками дрожжей без внесения толуола.
3. Кинетика накопления АТФ в культуральной жидкости
3. Кинетика накопления АДФ в культуральной жидкости
3. Кинетика накопления АМФ в культуральной жидкости
4. Использование иммобилизованных клеток дрожжей рода vii для процесса био трансформации
аденознна до адснозннфосфатов
4.1 Определение метаболической активности
иммобилизованных клеток дрожжей
4.2 Влияние количества клеток внутри гранул геля на метаболическую активность.
4.3 Определение метаболической активности
иммобилизованных клеток дрожжей в трех циклах.
4. Метаболическая активность иммобилизованных клеток в
первом цикле.
4. Метаболическая активность иммобилизованных клеток во втором цикле.
4. Метаболическая активность иммобилизованных клеток в третьем цикле.
4.4 Изучение в. шин и VI концен рации субстрата на метаболическую активность иммобилизованных клеток дрожжей.
4.5 Изучение влияния толуола на метаболическую активность иммобилизованных клеток дрожжей.
5. Биосинтез аденозннфосфатов из аденозина иммобилизованными клетками дрожжей
5.1 Использование иммобилизованных клеток дрожжей для многократного применения в процессе биотрансформации аденозина до аденозннфосфатов.
5.2 Три серии бнотрансформации аденозина в
адсно шнфосфа ты.
5.3 Трехцикловая биотрансформанин аденозина в
аденозннфосфаты с подращиванием иммобилизованных клеток после каждого цикла
5.4 Трсхцнкловая биотрансформация аденозина в
аденозннфосфаты е подращиванием и обработкой толуолом иммобилизованных клеток после каждого цикла.
IV. Выводы
V. Список литера туры Приложение
0
Условные обозначении.
1. АТФ, АДФ, АМФ. Аденозин три, ди, монофосфат.
2. ПАВ Поверхностно активные вещества.
3. УБЛ Удельная бродильная активность. Представляет собой отношение объема выделившегося газа к единице биомассы.
4. УФА Удельная фосфорнлирующая активность. Представляет собой отношение концентрации нуклеотида к единице биомассы.
Введение


При изучении состава адениловых производных у различных микроорганизмов установлено, что содержание АТФ было наибольшим среди других нуклеозидфосфатов . В клетках бактерий обнаружены следующие соотношения АМФ. АДФ, АТФ у , , . В клетках хемостатной культур. Ия ВКМУ обнаружены следующие соотношения АМФ, АДФ и АТФ 1. Ннотрансформации аденозина до адеиозинфосфагов. Понятием биотрансформация или биопрсвращенмя охватываются процессы, при которых микроорганизмы превращают вещества в определенные продукты, структура которых связана со структурой исходных веществ. Такие процессы в отличие от многостадийных реакций ферментации имеют дело только с одной или ограниченном числом реакций, катализируемых ферментами. Известны тысячи процессов биопреврашений. В таблице 1 перечислены некоторые из многих типов реакций, которые были осуществлены с помощью микробных клеток. Таблица 1. Типы реакций бнотрансформацнн. Впервые о возможности фосфорилирования аденозина до АТФ с помощью дрожжей сообщили и соавторы . Автор,i предложили метод получения АТФ и АМФ из аденозина с помощью свежих пивных дрожжей или ацетоного порошка из них. В реакционной смеси, содержащей 1 раствор аденозина, фрукгозодифосфат или фосфоглицериновую кислоту, 0. М фосфатный буфер и препарат дрожжей 0 г АСБл, наблюдали образование аденозинполифосфатов. Из одного фамма аденозина было получено более 0. Авторы указывают, что фосфоршшрованнс аденозина ферментными системами дрожжей строю специфично гуанозин и рибоза не фосфорнлируются, присоединение фосфорнокислой группы происходит специфично у углерода рибозы в положении 5, образование дрожжевой адениловой кислоты аденозииЗфосфорная кислота не наблюдается. Авторами показано, что промытые аиетонвысушениые дрожжи или сухие дрожжи после продолжительного хранения не образуют из аденозина и фосфата адсниловую кислоту, но после внесения в среду гексозодифосфата или фруктозоднфосфата наблюдалось интенсивное фосфорилирование. Следовательно, необходимым условием для синтеза адениловой кислоты из аденозина является наличие фруктозодифосфорной кислоты. Но результатам опытов был сделан вывод, что синтез адениловой кислоты из аденозина и фосфата есть окислительновосстановительное фосфорилирование. Отмечается принципиальное отличие в механизмах образования АТФ у микробной клетки, в частности у рода vii, и мышечной ткани. Аденозин в дрожжах выступает в роли фосфатпередаюшего кофермента. Свободный аденозин фактически отсутствует в свежих дрожжах. Те же авторы показали, что аденозин образуется в дрожжах. При использовании промытых ацетоивысушенных дрожжей, не содержащих питательных веществ, не способных добавки фруктозодифосфориой кислоты к фосфорилированию аденозина, для инкубации с мышечной адениловой кислотой и толуолом наблюдается дефосфорилирование АМФ до аденозина, который накапливается в среде. В течение часов инкубации 1 грамм такого препарата разлагает 0 мг АМФ до аденозина. Гидролитический распад аденозина до адснина и рибозы протекает много медленнее, чем дефосфорилирование АМФ. ЛМФ. В течение часов сумма адеиозин АМФ остается постоянной. Авторы предполагают существование в дрожжах двух механизмов синтеза аленозинполифосфорных кислот из аденозина по первому адеиозин в окислительновосстановительном превращении взаимодействует с фруктозодфосфорной кислотой при участии неорганического фосфата при другом фосфоглицериновая кислота выступает в качестве донора фосфата, а также связывается с неорганическим фосфатом, присутствующем в реакционной среде. Из этого следует важная роль системы аденозинАТФ в спиртовом брожении адеиозин в дрожжах принадлежит к фосфатпередающей коферментной системе. В изучены условия, при которых накапливается максимальное количество фосфатных эфиров сахаров. Этому способствует добавление плазмолитика 6 толуола к интактным дрожжам. В аэробных условиях синтез АТФ у дрожжей происходит в результате окислительного фосфорилирования в митохондриях. Окислительное фосфорилированис является процессом, при котором выделение энергии связано с окислением субстратов.