Создание векторов для тканеспецифической экспрессии генов эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе животных

• Автор: Иванова, Лариса Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Боровск
• Количество страниц: 98 с. : ил

Введение

1. Обзор литературы

1.1. Продукция рекомбинантных белков в составе молока трансгенных животных

1.2. Гены казеинов молока

1.3. Получение и использование рекомбинантных белков эри фопозтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека

2. Материалы и методы исследований

2.1. Используемые материалы и объекты исследований

2.2. Выделение ДНК

2.3. Расщепление плазмидной ДНК рестриктазами

2.4. Электрофоретическое разделение фрагментов ДНК

2.5. Элюция фрагментов ДНК из геля и их очистка

2.6. Лигирование
2.7. Трансформация плазмидной ДНК
2.8. Детекция трансгена методом ПЦРамплификации ДНК
2.9. Определение нуклеотидной последовательности ДНК
3. Результаты исследований и их обсуждение
3.1. Создание вектора, содержащего структурный ген эритропозтина человека и регуляторные районы гена аяТ казеина быка
3.2. Выделение, молекулярное клонирование структурной части гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека
3.3. Некоторые аспекты подготовки раствора ДНК для микроипъекций
3.4. Идентификация трансгена с использованием полимеразноцепной реакции
3.5. Использование полученных генных конструкций при создании ретровирусных векторов
Выводы
Практические предложения
Список используемой литературы


В последние годы быстрыми темпами развиваются биотехнологические программы по получению трансгенных животных с измененным генотипом. Одним из перспективных направлений в этой области является создание и использование сельскохозяйственных животных, синтезирующих рекомбинантные белки человека. Развитие этого направления связано с возможностью создания генных конструкций, которые при интеграции способны обеспечивать экспрессию данного гена в определенное время и в определенных органах или тканях. Во всем мире существует огромный коммерческий интерес к производству целого ряда белков, необходимых для проведения диагностических, терапевтических и профилактических мероприятий в медицине и ветеринарии. Преимущества использования сельскохозяйственных животных в качестве биореакторов очевидны. Молочная железа сельскохозяйственных животных обладает огромным потенциалом синтеза белков и является идеальным источником производства рекомбинантных белков. Необходимым условием для направленной экспрессии рекомбинантных белков в молочной железе трансгенных животных является использование в генных конструкциях регуляторных элементов генов белков молока. Анализ литературных данных . . . V. . . V . могут успешно использоваться для тканеспецифической экспрессии экзогенных белков в молочной железе сельскохозяйственных животных. В рамках данной проблемы интересными представляются эксперименты с генами, кодирующими белки, минимальные количества которых способны оказывать существенное влияние на физиологические процессы организма. В частности, к ним относятся белки, стимулирующие рост и дифференцировку клеток крови эритропоэтин ЭПО и гранулоцит колониестимулирующий фактор ГКСФ человека. Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью настоящей работы являлось создание векторов, содержащих гены, кодирующие эритропоэтин и гранулоцит колониестимулирующий фактор человека, для тканеспецифической экспрессии в молочной железе животных при проведении биотехнологических исследований по трансгенозу. Научная новизна работы. Впервые созданы отечественные векторные конструкции, содержащие кодирующие последовательности генов человека эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора, ткансспсцифичсская экспрессия которых обусловлена наличием в рекомбинантных плазмидах регуляторных элементов гена аз 1казеина быка. Определены оптимальные условия проведения анализа интеграции трансгена у эмбрионов млекопитающих ранних стадий развития. Практическая значимость. Созданные рекомбинантные плазмиды могут быть использованы в разработке технологий по получению трансгенных сельскохозяйственных животных, продуцирующих рекомбинантные эритропоэтин и гранулоцит колониестимулирующий фактор человека в составе молока. Па основе этих генных конструкций были созданы ретровирусные векторы для получения соматических трансгенных животных, продуцирующих клетками молочной железы белки, имеющие фармакологическое значение. Рекомбинантные плазмиды могут найти применение не только при проведении исследований в области трансгеноза, но и в дальнейших молекулярногенетических работах по клонированию с целью создания новых векторов. Метод определения интеграции трансгена на стадии эмбриона пригоден для практического использования при проведении анализа генома зародышей млекопитающих. Этот метод также можно применять при взятии биопсии у бластоцист с целью детекции трансгена и дальнейшей трансплантации только трансгенных эмбрионов. Тканеспецифическую экспрессию эритропоэтина и гранулоцит колониестимулирующего фактора человека в молочной железе трансгенных животных обеспечивают регуляторные элементы гена 1казеина быка . Нуклеотидная последовательность 12фрагмента созданной рекомбинантной плазмиды идентична опубликованной первичной структуре гена гранулоцит колониестимулирующего фактора человека. Предварительная обработка эмбрионов рестриктазой и протсиназой К перед проведением ПЦРанализа позволяет более достоверно определить интеграцию трансгена у бластоцист млекопитающих.