Структурные детерминанты, существенные для функционирования и стабильности протеолитических ферментов

• Автор: Костров, Сергей Викторович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 200 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ.

ВВЕДЕНИЕ. Прикладное значение протеолитнческих ферментов.

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Струкгурнофункциональная организация термолизинподобных

секреторных металло фотсиназ бацилл.

1.1.1. Общая характеристика молекул.

1.1.2. Организация активного центра.

1.1.3. Организация субстратсвязывающего кармана.

1.1.4. Организация сайтов связывания ионов Са2 .

1.2. Прозависимый фолдинг протеолитнческих ферментов.

1.3. Роль пропоследовательностей в фолдинге термолизинподобных

металлопротеиназ.
1.4. Молекулярные механизмы, определяющие стабильность белков.
1.5. Молекулярные основы стабилизации гермолизинподобных
металлопротеиназ.
1.6. Структурнофункциональная организация бактериальных
глутамилэцдопептидаз.
1.6.1. Общее описание группы сериновых протеиназ.
1.6.2. Основные физикохимические свойства глутамилэндопептидаз.
1.6.3. Субстратная специфичность глутамилэндопептидаз.
1.6.4. Первичные структуры известных глутамилэндопептидаз.
1.6.5. Особенности пространственной организации глутамилэндопептидаз.
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Микробные штаммы.
2.2. Культивирование микроорганизмов.
2.3. Трансформация клеток ВиЫШз.
2.4. Количественное определение белка.
2.5. Определение активности протеолитических ферментов.
2.6. Анализ субстратной специфичности протеиназ.
2.7. Определение аминоконцсвой последовательности.
2.8. Анализ уровня термостабильности неочищенных ферментов.
2.9. Ингибирование ферментов.
2 Определение энзиматических констант.
2 Очистка Йиспсцифичной иротсиназы ТИегтоасИ поту се р.
2 Выделение рекомбинантных метаплопротеиназ В.ii и
В. vi.
2 Выделение рекомбинантной глутам и л эндопептидазы В.ii.
2 Определение молекулярных масс ферментов.
2 Определение аминокислотного состава.
2 Определение рНоптимумов активности ферментов.
2 Анализ термостабильности ферментов.
2 Анализ р 1стабильности ферментов.
2 Выделение плазмидной ДНК.
2 Выделение ДНК бактериальных хромосом.
2 Электрофоретический анализ нуклеиновых кислот.
2 Ферментативный гидролиз ДНК.
2 Конструирование банков генов.
2 Определение нуклеотидной последовательности ДНК.
2 Конструирование генетических векторов для получения химерных
протеолитических ферментов.
2 Сайтнаиравленный мутагенез.
2 Статистическая обработка данных.
2 Стереопредставление молекул.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Скрининг микробных штаммов с целью выявления продуцентов
протеолитических ферментов, перспективных для практического использования.
3.2. Выделение и характеристика новой С1и,Аврснсиифичной
глутамилэндопептидазы i .
.3. Клонирование генов протеолитических ферментов.
.4. 1 редварительная характеристика продуктов экспрессии
клонированных генов.
.4.1. редварительная характеристика рекомбинантной металлопротеиназы
В. .
.4.2. 1 редварительная характеристика рекомбинантных металлопротеиназ
В.vi 2С и В.vi IXЬ.
3.4.3. Предварительная характеристика рекомбинантной металлопротеиназы
В. i.
3.4.4. Предварительная характеристика рекомбинантной сериновой
протеиназы i .
3.4.5. Экспрессия гена металлопротеиназы В. vi в клетках .ii.
3.5. 1 оиск участков метаплопротеиназ, существенных для
термостабильности молекул.
3.6. Конструирование и характеристика химерных метаплопротеиназ
бацилл.
3.7. Определение и анализ нуклеотидной последовательности гена
глутамилэндо1 гсптидазы В. ii.
3.8. Рентгеноструктурный анализ глутпмилэндопептидазы В.ii.
3.9. Конструирование и характеристика мутантной
глу гамилэндопептидазы В.ii.
3.9.1. Очистка и характеристика рекомбинантной глу гамилэндопептидазы
В ii.
3.9.2. Конструирование и характеристика мутантной
глутам и лэндопептидазы В.ii, несущей аминокислотную замену i .
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ


Однако основным выводом из этих работ является то, что наше понимание структурнофункциональных взаимосвязей в белковых молекулах и молекулярных механизмов их функционирования весьма далеко от совершенства и эта важнейшая область молекулярной биологии нуждается в дальнейшем развитии. В последующих разделах литературного обзора будут проанализированы особенности структурнофункциональной организации протеолитических ферментов двух групп, изучению которых посвящена основная часть экспериментальных исследований автора термолизинподобных металлопротеиназ и химотрипсинподобных сериновых протеиназ. Актуальность работы. Все это определяет се высокую актуальность. Работа поддержана грантами Российского фонда фундаментальных исследований и ГНТП Новейшие методы биоинженерии. Цель работы. Целыо работы явился поиск новых природных ферментов, перспективных для практического использования, и изучение структурнофункциональных взаимосвязей в белковых молекулах на модели протеолитических ферментов. Научная новизна. В ходе данной работы впервые был сконструирован набор гибридных генов, кодирующих функционально активные химерные протеолитические ферменты, и продемонстрирована возможность получения стабильных протеиназ со значительно модифицированной структурой. На основе детального анализа свойств сконструированных химерных ферментов локализованы ранее не идентифицированные районы молекулы, существенные для стабильности и функционирования белка в целом. На основе анализа установленных первичной и пространственной структур глутамилэндопептидазы i ii продукта экспрессии клонированного гена, детальной характеристики свойств нативного белка и его мутантного аналога, предложена модель функциональной организации данного фермента и выдвинута гипотеза о существовании функциональных детерминант нового типа, вовлеченных в процесс распознавания глутамнлэндопептидазами заряженных субстратов. Практическая значимость. В ходе данной работы проведен широкомасштабный скрининг, направленный на поиск новых протеолитических ферментов, перспективных дтя научного и практического использования. Идентифицирован ряд микробных штаммов, продуцирующих высокостабильные нейтральные и ссриновые протеиназы, коллагеназы, активные при пониженной температуре, и высокоспецифичную глутамилэндопептидазу. Клонирован и экспрессирован набор генов, кодирующих протеолитические ферменты идентифицированных микроорганизмов. Осуществлена характеристика продуктов их экспрессии. Положения, выносимые на защиту. Проведение широкого скрининга микроорганизмов, направленного на идентификацию продуцентов протеолитических ферментов, перспективных для научного и практического использования. Клонирование и экспрессия генов, кодирующих протеолитические ферменты идентифицированных микробных штаммов и характеристика свойств соответствующих белков. Разработка экспериментального подхода для получения химерных протеолитических ферментов и использование данной модели с целью идентификации функционально существенных областей белковых молекул. Конструирование и характеристика мутантной глутамилэндопептидазы В. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Общая характеристика термолмшнподобнмх металлопрогсиназ. Классификация протеиназ в значительной степени сложилась на базе ранних работ, связанных, в основном, с характеристикой физикохимических свойств и субстратной специфичности ферментов. В результате последующего развития молекулярной биологии и биохимии в качестве наиболее значимою критерия стали выдвигать эволюционное родство, выявляемое на основе сопоставления первичных и пространственных структур белковых молекул. В наиболее общем виде классификация протеиназ приведена в таблице 2. При этом представленные группы разбиваются в дальнейшем на десятки подгрупп, критерии выделения которых часто неравноценны, а в некоторых случаях не очевидны. Мегаллопротсиназы являются наиболее распространенным типом прогеолитических ферментов 1 и характеризуются наличием в структуре молекулы двухвалентного иона металла чаще всего Со , Мп, реже Са2, 2 , необходимого для процесса катализа. Это объясняет ингибирование их активности такими хелатирующими агентами, как этилендиаминтстрауксусная кислота ЭДТА, офенаитролин и другие. М3 включает ферменты обеих групп.