Исследование рецептор-опосредованной трансфекции клеток эпителия молочной железы in vitro и in vivo

• Автор: Смирнова, Ольга Анатольевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 100 с. : ил.

Оглавление.

Список сокращении

Введение

Обзор литературы

1. Рецепторопосредованпая трансфекции

1.1. ДНКпереносящие конструкции для рсцепторопосредованной трансфекции

1.1.1. ДНК

1.1.2. Лиганды.

1.1.3. Поликатионы.

1.1.4. Компактизация ДНК и размеры трансфецирующих комплексов

1.2. Транспорт ДНКпереносящих конструкций.

1.2.1. Эндоцитоз.
1.2.2 Внутриклеточный транспорт конструкций
1.2.2.1. Транспорт через мембрану эндосом.
1.2.2.2. Транспорт в ядро.
2. Использование аденовирусов для усиления эффективности трансфекции
2.1. Транспорт аденовирусов
2.2. Влияние аденовирусов на транспорт макромолекул в клетки.
2.3.Усиление рецепторопосредованной доставки генетического материала
2.4. Включение аденовирусов в систему рецепторопосредованной доставки ДК.
2.5. Действие аденовирусов на другие методы трансфекции
3. Доставка генетического материала i viv
3.1. Способы введения ДНКпсрсносящих конструкций i viv
3.2. Некоторые особенности рсцепторопосредованной трансфекции i viv
3.2.1 Введение ДНКпсрсносящих конструкций и иммунный ответ организма
3.2.2 Пути увеличения продолжительности экспрессии трансгсна.
3.2.2.1. Частичная гепатэктомия.
3.2.2.2. Оптимальная конденсация ДНК
4. Животныебиореакторы
5. Заключение
Материалы и методы.
1. Культура клеток.
2. Животные
3. Выделение и очистка аденовирусов
4. Биотинилироваиие аденовирусов.
5. Анализ выхода содержимого липосом.
6. Синтез и очистка конъюгатов.
6.1. Стрептавидинполилизин
6.2. Инсулинполилизин.
7. Флуоресцентное мечение конъюгатов.
8. Плазмидная ДНК
9. ДНКпсреносящие конструкции.
. Электрофорез конструкций
. Трансфекция клеток в культуре.
. Исследование транспорта конструкций в клетки НС
. Введение трансфецирующих конструкций в молочные железы животных
. Анализ активности люциферазы
.1. Получение клеточных и тканевых лизатов.
.2 Определение содержания белка в пробах.
.3. Определение активности люциферазы
. Вестернблот анализ.
Результаты.
1. Сборка ДНКпсреносящнх конструкций.
1.1. Синтез компонентов ДНКпереносяших конструкций.
1.2. Оценка связывания ДНК с конъюгатом инсулинполилизин.
1.3. Сборка ДНКпереносяших конструкций.
2. Исследование транспорта ДНКпереносящнх конструкций в клетки линии НС методом видеоингенсификационной микроскопии.
2.1. Транспорт конъюгата инсулинполилизин
2.2. Транспорт флуоресцентномеченной ДНКпереносящей конструкции в клетки линии НС.
2.3. Внутриклеточная локализация ДНКпереносящих конструкций
3. Влияние аденовирусов на проницаемость фосфолипидной мембраны.
3.1. Выход содержимого липосом под действием аденовирусов.
3.2. Мембранолитическая активность аденовируса, включенного в состав ДНКпереносящей конструкции.
4. Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши i vi
4.1. Трансфекция клеток эпителия молочной железы мыши линии НС конструкцией инсулинполилизинДНК
4.2. Использование аденовирусов для усиления рецепторопосредованной трансфекции.
4.2.1. Трансфекция в присутствии свободных аденовирусов
4.2.2. Трансфекция конструкциями инсулинполилизинДНКстрептавидинполилизинадсновирус
4.2.3. Оптимизация содержащих вирус конструкций
5. Рецепторопосредованнаи трансфекция эпителия молочных желез i viv
5.1. Трансфекция молочных желез мыши
5.2. Трансфекция молочных желез овец
6. Секреция модифицированной люциферазы в молоко после трансфекции молочной железы i viv.
6.1. Секреторные формы люциферазы.
6.2. Анализ активности люциферазы в молоке трансгенных животных.
Обсуждение результатов
Выводы.
Список литературы


Рецепторопосредованная доставка генетического материала сочетает использование естествен но для клетки механизма рецептороиосрсдованного транспорта и синтетических лигаидированных конструкций, что, в принципе, может позволить специфически трансфецировать любой выбранный тин клеток i i, . Этот метод дает возможность трансфецировать также дифференцированные и неделящиеся клетки. Он применяется для трансфекции i vi и i viv. Данный метод позволяет легко варьировать и заменять компоненты конструкций, в том числе доставляемый генетический материал и адресный лиганд. Метод не накладывает строгих ограничений по последовательности и размерам молекул ДНК. Компоненты ДНКпереиосящих конструкций могут быть выделены плазмиды или синтезированы бифункциональные коиыогаты в достаточно большом количестве. Для внедрения метода в биотехнологию представляется важным дальнейшее исследование закономерностей и механизмов рецепторогюсредованной трансфекции и се оптимизация, особенно для применения i viv. Под руководством Соболева была разработана система рецспторопосредованной доставки генетического материала с инсулином в качестве лиганда Соболев, . Этот подход успешно использовался при трансфекции клеток гепатомы человека в культуре Розенкранц и др. Исходя из того, что клетки эпителия молочной железы обладают инсулиновыми рецепторами . Таким образом, на основании имеющейся на сегодня совокупности данных нами была предложена идея создания животногобиореактора путем рецеиторопосредованной трансфекции молочной железы. В развитие этой идеи и выполнялась данная работа. Целью настоящей работы было изучение возможности использования рецепторопосредованной доставки генетического материала в клетки эпителия молочных желез для получения целевых белков с молоком сельскохозяйственных животных. Исследовать рецепторопосредованный эндоцитоз и внутриклеточный транспорт конъюгата инсулинполилизин и ДНКпереносящих конструкций, содержащих данный конъюгат, в клетках эпителия молочной железы в культуре. Исследовать и оптимизировать состав и свойства ДНКпсрсносящих конструкций для получения наибольшего уровня трансфекции клеток в культуре. Осуществить рсцсптороиосредованную доставку репортериого гена в клетки эпителия молочной железы i viv. Оценить возможность рецепторопосредованной доставки гена, кодирующего секретируемый с молоком белок, в клетки эпителия молочной железы i viv. Обзор литературы. Человеческое знание неизмеримо во все стороны, и из того, что достойно знания, никто в одиночку не может знать даже и тысячной доли. В последние десятилетия получили широкое развитие методы создания рекомбинантных ДНК, доставки ДИК в клетки млекопитающих i vi и i viv, а также методы исследования экспрессии введенных генов. Эти технологические достижения привели к возможности практического применения в биотехнологии для производства белков клинической важности, ранее получаемых из природных источников, и в медицине для лечения генетических заболеваний путем интродукции нормального гена в соответствующие клетки больного организма генная терапия. Несмотря на то, что к настоящему времени разработано большое количество методов введения чужеродной ДИК, проблема эффективного транспорта ДНК i viv остается нерешенной , i , . Существует ряд требований, обеспечивающих возможность и эффективность применения i viv тех или иных систем доставки 1 направленность поступление ДНК в избранный тип клетоктканей, 2 эффективность, 3 отсутствие токсичности и безопасность для организма, 4 устойчивость при хранении и введении в организм, 5 технологичность и относительная дешевизна получения переносчиков ДНК, 6 отсутствие ограничений переносимой ДНК. Метод рецепторопосредованной трансфекции во многом соответствует этим требованиям i i, . Этот метод сочетает использование естественного для клетки механизма рецепторопосредованного транспорта и синтетических лигандированных конструкций, что, в принципе, может позволить специфически трансфецировать любой выбранный тип клеток. Он применяется для трансфекции клеток животных i vi и i viv. В настоящее время во многих научных лабораториях идет интенсивная работа по превращению потенциальных возможностей данного метода в реальный высокоэффективный способ направленной доставки генов i viv.