Исследование способности зрелых ооцитов кролика репрограммировать ядра эмбриональных и дифференцированных клеток

• Автор: Лагутина, Ирина Сергеевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Горки Ленинские
• Количество страниц: 146 с. : ил.

1. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Трансплантация ядер основные достижения последних лет.

1.2. Способность ооилазмы рспрограммировать трансплантированное ядро.

1.3. Фактор, стимулирующий созревание , и его роль в обеспечении репрограммирования ядра.

1.4. Синхронизация клеточных циклов донора и реципиента ядра.

2. ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

Объешы исследования. Выделение яйцеклеток и эмбрионов. Подготовка ооцитов к микрохирургической операции. Подготовка эмбрионов к микрохирургической операции.
Синхронизация бластомеров на iстадии клеточного цикла. Культивирование эмбрионов. Получение и культивирование фибробластов кролика.
Синхронизация фибробластов на стадии клеточного цикла. Микрохирургические операции.

Электрослияние. Оценка развития клонированных эмбрионов i vi.

Замораживание эмбрионов и фибробластов.

Трансплантация эмбрионов кролика.
Статистическая обработка.
3. ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Исследование эффективности энуклеации ооцитов и способности к развитию неэиуклеированных ооцитов с трансплантированными ядрами фетальных фибробластов.
3.2. Исследование факторов, влияющих на эффективность электрослияния оопластов с клетками донорами ядер
3.3. Исследование влияния возраста ооцитареципиента на способность к активации и эффективность развития реконструированных эмбрионов.
3.4. Исследование влияния синхронизации клеточных циклов донорского ядра и ооплазмы на эффективность развития клонированных эмбрионов.
3.4.1. Бластомеры морулы доноры ядер
3.4.2. Фетальные фибробласты доноры ядер.
3.4.2.1. Характеристика культуры ф спальных фибробластов.
3.4.2.2. Исследование синхронизации фетапьных фибробластов на стадии клеточного цикла в истощенной среде.
3.4.2.3. Исследование влияния состояния клеточного покоя стадия клеточною цикла
фетальных фибробластов на эффективность развития клонированных эмбрионов.
3.5. Влияние возраста клеток доноров ядер на эффективность развития клонированных эмбрионов.
3.5.1. Влияние возраста донора клеток для трансплантации ядер на эффективность развития клонированных эмбрионов.
3.5.2. Эффективность репрограммирования ядер фетальных фибробластов в зависимости от числа пассажей клеточной культуры.
3.6. Оценка полноценности репрограммирования ядер бластомеров морулы и фетальных фибробластов в ооплазме стареющих ооцитов.
3.6.1. Бластомеры морулы доноры ядер.
3.6.2. Фетальные фибробласты доноры ядер.
ОБСУЖДЕНИЕ
ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
ВВЕДЕНИЕ


Обнаружена отрицательная корреляция между возрастом организма донора клеток для трансплантации ядер и эффективностью развития клонировашьх эмбрионов до стадии бластоцисты. Подтверждена тотипотентность ядер морулы, их способность обеспечивать развитие клонированных эмбрионов вплоть до рождения. Показана способность ядер фетальных фибробластов обеспечивать развитие клонированных эмбрионов вплоть до имплантации. Исследовано состояние ядерного материала стареющих ооцитов. Показано увеличение способности к активации и обеспечению развития реконструированных эмбрионов до предымплантационных стадий в процессе старения ооцита. Обнаружено снижение эффективности слияния клстокдоноров ядер с ооцитами с увеличением возраста ооцитов. Показано влияние длительности сывороточного голодания фетальных фибробластов на эффективность их слияния с оопластами. Практическая значимость работы. Разработаны методические приемы энуклеации зрелых ооцитов и трансплантации клеток доноров ядер под блестящую оболочку яйцеклетки. Определены наиболее оптимальные временные параметры для активации клонированных эмбрионов кролика, реконструированных с использованием стареющих ооцитов, а именно часа после инъекции ХГ. Разработан способ получения реконструированных эмбрионов с ядрами бластомеров морулы, синхронизированными на в 1 стадии клеточного цикла, позволяющий в 2 раза повысить эффективность развития клонированных эмбрионов кролика до стадии бластоцисты. Ядра бластомеров синхронизируют на стадии метафазы деления дробления с помощью колцемида. Трансплантация бластомера в перивителлиновое пространство энуклеированного ооцита и слияние полученной конструкции кариопластоопласт производятся в течение минут после деления клетки. Предложена истощенная среда для быстрого вывода клеток в культуре в состояние клеточного покоя и определены временные параметры наиболее эффективного се использования. Истощенная среда основана на среде ДМЕМ, с добавлением 0,5 фетальной сыворотки коров. М. Истощенная среда обеспечивает быструю синхронизацию фибробластов на стадии клеточного цикла уже через 2 суток культивирования. Эффективности развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты при трансплантации ядер синхронизированных фибробластов увеличивается в 3 раза но сравнению с развитием эмбрионов с ядрами циклирующих фибробластов. Автор выражает благодарность за помощь в обсуждении результатов работы и ценные критические замечания руководителям работы М. И. Прокофьеву и В. В. Галату а также В. Я. Черныху, М. Н. Мезиной за помощь в организации экспериментов М. В. Пилюгиной, А. В. Захарову, Турину, Н И. Шенелю, Кудряшову ИТЭБ РАН за помощь в подготовке и проведении экспериментов В. И. Захарченко за помощь в практическом освоении методик и при обсуждении результатов работы. ГЛАВА 1. Трансплантации ядер основные достижения последних лет. Развитию метода транплантации ядер и получения клонированных животных посвящено несколько обзоров Васецкий, Ротг, Котпохов, , , , , , . В настоящее время достигнуты значительные успехи в изучении способности ядер различных эмбриональных и дифференцированных клеток
к репрограммированию в цитоплазме зрелого энуклеированного ооцита и обеспечению полноценного развития клонированных эмбрионов вплоть до рождения. К настоящему времени доказано, что ядра морулы тотипотентны. Эффективность развития клонированных эмбрионов с ядрами морулы до предымплантационных стадий развития достаточно высока у разных видов животных Таблица 1. При трансплантации клонированных эмбрионов самкамреципиентам было получено полноценное потомство у кроликов i, , . Захарченко с соавт. Таблица 1. Однако, клетки тотипотентны. I . Разработка условий
культивирования клеток внутренней клеточной массы позволила повысить до эффективность развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты Таблица 1. Эффективность развития клонированных эмбрионов до стадии бластоцисты. Бластомеры овцы . I . Клетки кролики 0 , , 9,6. Клетки внутренней коровы . I . Линии эмбрио овцы i . Герминативные мыши 0 . Фетальные овцы i . В году в лаборатории Ферста i, i, i .