Биотехнологические способы получения нуклеозид-5`-трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора

• Автор: Скоблов, Юрий Самойлович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 2010
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 137 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР

1. Методы синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.

1.1.Методы синтеза уР 7.

1.1.1. Химические методы

1.1.2. Химикоферментативные методы.

1.1.3. Ферментативные методы

1.2.Синтез нуклеозид5аРтрифосфатов.

1.2.1. Синтез нуклеозид 5Рмонофосфатов

1.2.1.1. Химические методы

синтеза нуклеозид 5Рмонофосфатов.
1.2.1.2. Ферментативные методы
синтеза нуклеозид 5Рмонофосфатов.
1.2.2. Методы фосфорилирования нуклеозидРмонофосфатов до нуклеозид5аРтрифосфатов.
1.2.2.1. Химические методы.
1.2.2.2. Ферментативные методы.
2. Нуклеотидкиназы ферменты, фосфорилирующие 1МР.
2.1.Бактериальные АТФ нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы
2.2.АТФ нуклеозидмонофосфат фосфотрансферазы млекопитающих
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
1. Создание технологии получения нуклеознд5трнфосфатов,
меченных радиоактивными изотопами фосфора.
1.1 Синтез нуклеозид5уР трифосфатов.
1.1.1. Синтез уРАТР реакцией обмена
1.1.2. Синтез уРАТР по прямой реакции из АЭР.
1.1.3. Синтез конверсией из уРАТР.
1.2 Синтез нуклеозид5аР трифосфатов
1.2.1 Синтез нуклеозид5 Р монофосфатов
химическим фосфорилированием
1.2.2 Ферментативный синтез нуклеозид5Р монофосфатов.
1.2.3. Ферментативное фосфорилирование нуклеозид5Р
монофосфатов
1.3 Очистка нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами
фосфора.
2. Разработка критериев качества нуклеозид5трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.
2.1 Основные критерии качества меченых соединений.
2.2 Биологическая активность дополнительный критерий качества меченых соединений
3. Создание ферментативной базы для производства нуклеозид5трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора
3.1. Ферменты для синтеза у 2РАТР
3.2. Ферменты для синтеза
3.3 Ферменты для фосфорилирования
3.3.1 Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ из .i
3.3.2 Свойства нуклеозидмонофосфаткиназ .i
3.3.3 Свойства дезоксинуклеозидмонофосфаткиназы бактериофага Т5
3.4 Фермент для фосфорилирования 5.
4. Радиопротектор для Рмеченых нуклеотидов.
5. Технологическая линия по получению нуклеозид5трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора.
6. Получение модифицированных нуклеотидов, меченных
радиоактивными изотопами фосфора
6.1 Синтез модифицированых нуклеозид5а 2сззР трифосфатов
терминаторов биосинтеза ДНК.
6.2. Синтез нуклеозид5р Р дитрифосфатов.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
1. Материалы.
1.1. Реактивы и ферменты.
1.2. Хроматографические сорбенты и колонки
1.3. Непромышленные препараты.
2. Методы
2.1. Приготовление раствора триэтиламмоний бикарбоната ТЕАВ
2.2. Выделение нуклеозидмонофосфаткиназ . i
2.3. Определение активности нуклеозидмонофосфаткиназ.
2.4. Определение нуклеотиддефосфорилирующих примесей в препаратах нуклеозидмонофосфаткиназ.
2.5. Определение оптимума для реакций, катализируемых нуклеозидмонофосфаткиназами
2.6. Определение влияния ионов двухвалентных металлов на активность нуклеозидмонофосфаткиназ
2.7. Изучение субстратной специфичности нуклеозидмонофосфаткиназ
2.8. Определение концентрации белка
2.9. Очистка цитидилаткиназы Е. со И 0 до гомогенного состояния.
2 Методы электрофореза.
. Электрофорез белков
. Электрофорез нуклеиновых кислот
2 Тсстирование биологической
активности уР1 и аР
. Тестирование биологической активности у Р
. Тестирование биологической активности а2Р .
. Тестирование биологической активности а Р
.1. Метод никтрансляции.
.2. Метод случайной затравки.
2 Ферментативный синтез аР сМТР.
2 Хроматографическая очистка уР ЫТР и аРс1ЫТР.
. Хроматографическая очистка на колонках с РЕ1целлюлозой.
. Ионообменная ВЭЖХ
. Обратнофазовая ВЭЖХ.
2 Химическое фосфорилирование нуклеозидов.
Общая методика синтеза 3азидо2,3дидезокситимидин5 Р
фосфата 5Р АгТМР активацией ТР8С1, ТОМ, ЕЮС и МСС.
. Синтез 3азидо2,3дидезокситимидин5 Рфосфата активацией
Препаративное химическое фосфорилирование нуклеозидов
Список сокращений.
Благодарности.
Библиография


Низкая концентрация радиоактивного вещества требует использования большого избытка нерадиоактивиых компонентов для увеличения скорости и выхода реакции, что часто приводит к появлению побочных соединений. При высокой объемной активности 1 Кимл в реакционной смеси быстро накапливаются неидентифицированные продукты, индуцированные ионизирующим излучением, поэтому время проведения всех стадий процесса, включая анализ выхода промежуточных продуктов, необходимо минимизировать. УФ и ИКспектроскопию. Высокая активность на рабочем месте требует определенных мер по соблюдению техники радиационной безопасности и вынуждает проводить технологический процесс в соответствующих защитных боксах. Среди методов синтеза нуклеозид5трифосфатов, меченных фосфором и фосфором, можно выделить химические, химикоферментативные и ферментативные методы. Высокая скорость вместе с высокой специфичностью и технологичностью делают ферменты незаменимым инструментом для проведения сложных радиохимических синтезов. Основным ограничением ферментативных и химикоферментативных методов синтеза является отсутствие высокоочищенных ферментов и недостаточно полная информация об их субстратной специфичности и стабильности в условиях радиохимического синтеза. Поэтому прикладные разработки технологических ферментативных схем синтеза меченых нуклеотидов сопряжены с работой по получению очищенных ферментов и фундаментальными энзимологическими исследованиями. Следует подчеркнуть, что по уровню радиохимических работ, включая производство различных радионуклидов, к концу х годов XX века наша страна занимала лидирующее положение в мире. База, имеющаяся в стране по наработке и выделению из мишеней реакторных и циклотронных изотопов, охватывала широкий спектр радионуклидов и не имела аналогов. Однако, биохимические аспекты получения соединений, меченных радиоактивными изотопами, существенно отставали от радиохимических разработок. Разработка эффективных методов синтеза нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, в масштабе не менее 0 мКм по радиоактивному сырью. Разработка методов очистки целевых соединений. Разработка методов промежуточного технологического контроля и контроля качества конечного продукта. Создание ферментативной технологической базы, необходимой для реализации технологии получения нуклеотидов, меченных радиоактивными изотопами фосфора. Внедрение разработанных методов в серийное производство. Создание эффективного радиопротектора, обеспечивающего увеличение срока годности синтезированных меченых соединений. Разработка, согласование и утверждение нормативнотехнической документации, необходимой для серийного производства. Методы синтеза нуклеотидов и нуклсозид5трифосфатов, меченных радиоактивными изотопами фосфора, описаны весьма фрагментарно, при этом большая часть литературных источников относится к г. XX века. Основная причина этого беспрецедентный спрос на нуклеозид5трифосфаты, меченные радиоактивными изотопами фосфора, возникший в конце х годов, и, как следствие, коммерческий интерес фирмпроизводителей меченых соединений, не заинтересованных в публикациях технологических разработок. Первоначально радиоактивный изотоп фосфор получали по реакции Рп,у Р облучением нейтронами неорганического соединения, содержащего атом фосфора 7. Чаще всего использовали соли ортофосфорной кислоты, иногда элементарный красных фосфор, при этом молярная активность полученного продукта не превышала 0. Киммоль и была ниже, чем у тритиевых соединений. Развитие молекулярной биологии и смежных областей требовало повышения чувствительности изотопных методов, которая лимитировалась молярной активностью меченых соединений. Это повлекло за собой переход на получение фосфора по реакции Эп, рР нейтронным облучением элементарной серы так называемый фосфор без носителя сатегГгее. Гак как в природной сере содержание изотопа серы более , то для получения фосфора в качестве мишени используют природную серу высокой химической чистоты. Теоретически возможная молярная активность фосфора без носителя при 0ном изотопном обогащении составляет КимАт. На практике молярная активность Рортофосфорной кислоты без носителя колеблется в пределах Киммоль.