Выделение продуцентов бета-специфичной циклодекстринглюканотрансферазы и получение ферментных препаратов на их основе

• Автор: Терехова, Елена Яковлевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 110 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Бактерии продуценты ЦГТаз. Развитие методов скрининга и таксономическое изучение

1.1. Реакции, катализируемые ЦГТазой

1.2. Источники ЦГТаз

1.3. Продуценты ЦГТаз

1.3.1. Аэробные спорообразующне бактерии продуценты I ЦТ аз

1.3.1.1. Вид i

1.3.1.2. Алкатофильныс продуценты Ц1 Газ

1.3.1.3. Продуценты ЦГТаз рода i развивающиеся при нормальном значении питательных сред
1.3.2.Ц1 Тактивные продуценты, не относящиеся к роду i
1.3.3.Идентификация продуцентов I ЦТазы
1.4. Скрининг. Процедуры скрининга и накопительные среды
1.5.Основные микробные контаминанты при выделении ЦГТактивных бактерий. Продуценты циклодекстриназ
1.6.Производство циклодекстринов
1.6.1.Технологические этапы получения циклодекстринов
1.7. Заключение ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Объекты исследований
2.2. Материаты и реагенты
2.3. Микробиологические методы
2.3.1. Питательные среды
2.3.1.1. Накопительные питательные среды для скрининга на основе циклодекстринов
2.3.1.2. Жидкие питательные среды для наработки образцов ЦГТазы
2.3.2. Условия культивирования и инокуляции
2.3.3. Почвенные образцы и их подготовка для выделения новых бактериальных изолятов
2.3.4. Методы таксономических исследований
2.3.4.1. Определение культур, обладающих амилогидролазной активностью
2.4. Методы биохимических исследований
2.4.1. Определение активности циклодекстринглюканотрансферазы
2.4.1.1. Модифицированный метод ТильденаХадсона
2.4.1.2. Спектрофотометрический метод с использованием фенолфталеина
2.4.2.0пределение концентрации белка
2.4.3. Осаждение фермента этанолом
2.4.4. Определение термостабильности фермента
2.4.5. Изучение специфичности ЦГТаз штаммов i методами ВЭЖХ
2.5. Статистический анализ результатов экспериментов
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
3.1. Разработка системы скрининга ЦГТактивных бактерий и экспрессоценки специфичности секрстируемых ими ферментов
3.2. Сравнительная эффективность разработанных схем скрининга
3.3. Направленный скрининг микроорганизмов, продуцирующих Зспецифичные
ЦГТазы
3.4. Видовой таксономический анализ бациллярных изолятов, продуцирующих 3ЦГТазы. Анализ вариаций внеклеточной ЦГТазной активности на выборке диких изолятов
3.5. Разработка технолог ии 3ЦГТазы и масштабирование процесса для испытания в полупромышленных условиях
3.5.1. Выбор продуцента
3.5.2. Оптимизация условий лабораторною культивирования продуцента i i ИБ в качалочных колбах. Подбор состава питательной среды. Опытная
ферментация в лабораторном ферментере АК0. Наработка сырого препарата ЦП азы
3.5.3. Культивирование продуцента i i ИБ в полупромышленных условиях
ВЫВОДЫ
ЛИТЕРАТУРА


Методами перебора прокариотических изолятов, разрушающих крахмал на агаризоиаиных средах, из 0 тестированных колоний удается получить лишь единичные штаммы, несущие циклизующую активность ii, . Лишь недавно Усанов, была разработана процедура скрининга бактерий вида i , к сожалению, являющихся специфичными и, таким образом, неэффективными при получении ЦД. ЦГТактивные микроорганизмы обычно не способны к гидролитическому расщеплению крахмала, осуществляемому вне клетки. С точки зрения систематической микробиологии они локализованы в узких видовых кластерах, наиболее известным среди которых является вид i . Немногочисленные работы, посвященные скринингу культур с циклизующей активностью внеклеточной ферментативной активностью, приводящей к
образованию циклических декстринов, показывают, что эти бактерии образуют в микробном мире изолированную и малоизученную нишу, являющуюся также весьма консервативной ii, , i, , I, Усанов, . Способность к синтезу циклических альфаглюканов не распространяется широко среди других микроорганизмов и, по всей видимости, отсутствует у эукариотов. В коллекциях микроорганизмов в настоящее время насчитывается всего лишь несколько десятков бактерий с цикяизующей амилоденолимеразной активностью. Вместе с тем, альтернативный путь внеклеточного гидролитического расщепления крахмалоподобных альфаполиглюканов встречается повсеместно как у бактерий, так и у эукариотов. Известны и изучены тысячи культур и штаммов различных бактерий, актином и цетов и грибов, секретирующих разнообразные амилогидролазы. Весьма интересен также факт обнаружения бактерий, трансформирующих с помощью соответствующих ферментных систем инулин и декстран соответственно в циклофруктаны и циклодекстраны , , , . Опубликованные данные свидетельствуют, что найденные микроорганизмы в систематическом отношении весьма близки к наиболее известным продуцентам ЦГТаз. Все это делает интересной и актуальной задачу дальнейшего развития специфических методов скрининга ЦГТактивных микроорганизмов, локализации новых таксономических групп бактерий, способных к образованию ферментов, ответственных за синтез макроциклических олигосахаридов, и их детального изучения. Технология промышленного синтеза никло декстринов, основанная на энзиматической трансформации крахмала микробными ферментными препаратами, далека от совершенства изза своей чувствительности к различным факторам. Это приводит к низким выходам целевого продукта и его высокой себестоимости. Основным резервом улучшения техникоэкономических показателей существующих технологий циклодекстринов является поиск новых микроорганизмов, продуцирующих ЦГТазы с биохимическими параметрами более приближенными к требуемым в конкретном технологическом процессе. В связи со сказанным выше, целью настоящей работы являлась разработка обшей методической концепции выделения новых высокотехнологичных культурпродуцентов 3ЦГТаз, испытание ее в лабораторной практике, создание коллекции 3ЦГТактивных штаммов, выделенных из природных мест обитания, подбор культуры, перспективной для масштабного биотехнологического синтеза 3ЦГТазы и испытание ее на практике. Изучить возможности направленною скрининга продуцентов 3ЦГТаз с использованием накопительных элективных сред на основе циклодекстринов в сочетании с подбором условий инкубации. Провести массированный скрининг 3ЦГТактивных культур. Создать лабораторную коллекцию этих микроорганизмов, изучить их таксономическое положение. Подобрать активный штамм, пригодный для получения 3ЦГТазы. Оптимизировать условия культивирования предложенного штамма для получения максимального выхода ЦГТазы. Научная новизна работы. Впервые показано, что бактерии, обладающие генами 3ЦГТазы, не являются эндемичными и могут быть выделены практически из любого образца лесной и луговой почвы. Получены данные, характеризующие нормальный физиологический уровень внеклеточной 3ЦГТазной активности диких изолятов при их выращивании на жидких средах. Экспериментально продемонстрировано, что он находится на уровне ,5 сд. Рассчитанная в большой выборке изолятов вероятность обнаружения продуцентов 3ЦГТазы с активностью в раза более высокой, чем средняя, составляет величину .