Получение и анализ трансгенных растений пшеницы (Triticum aestivum L.) с агробактериальным геном изопентенилтрансферазы (ipt)

• Автор: Терешонок, Дмитрий Викторович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 134 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ5

ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 8

1.1. Влияние переувлажнения почвы на растения 8

1.2. Механизмы адаптации растений к анаэробному стрессу

1.2.1. Морфологоанагомические приспособления растений к анаэробному стрессу

1.2.2. Метаболическая адаптация растений к гипоксии и аноксии

1.3. Гормональная регуляция при гипоксии и аноксии

1.4. Образование активных форм кислорода при анаэробном стрессе

1.5. Биотехнологические подходы создания устойчивых к анаэробному стрессу растений.

1.5.1. Клеточная селекция

1.5.2. Генетическая инженерия
1.6. Методы, применяемые при получении трансгенных растений пшеницы
1.6.1. Поглощение Д К протопластами пшеницы
1.6.2. Электропорация
1.6.3. Баллистическая трансформация пшеницы.
1.6.4. Агробактериальная трансформация пшеницы
1.7. Фитогормоны
1.8. Общая характеристика цитокининов
1.8.1. История открытия
1.8.2. Химическая структура и функции
1.8.3. Биосинтез цитокининов
1.8.3.1. Прямой путь биосинтеза цитокининов
1.8.3.2. Биосинтез цитокининов из тРНК
1.8.4. Метаболизм цитокининов в растениях
1.8.4.1. Конъюгация цитокининов в растении
1.8.4.2. Разрушение цитокининов в растениях
1.9. Получение трансгенных растений с геном
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1. Растительный материал.
2.2. Среды для культивирования растений и растительных тканей
2.3. Получение каллуса и регенерация растений пшеницы
2.4. Характеристика вектора для трансформации
2.5. Среды и условия для культивирования агробактерии
2.6. Методы молекулярной биологии
2.6.1. ПЦРатализ ДНК трансгенных растений
2.6.2. Анализ транскрипции генов методом ОТПЦР
2.6.3. Гибридизация ДНК по Саузерну
2.7. Определение содержания МДА
2.8. Определение активности суиероксиддисмутазы
2.9. Определение активности каталазы.
2 Статистическая обработка результатов.
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЯ.
3.1. Получение трансгенных растений пшеницы
3.1.1. Обоснование выбора экспланта для трансформации
3.1.2. Подбор оптимальной концентрации селективного агента.
3.1.3. Освобождение от бактериальной инфекции
3.1.4. Выбор оптимальной схемы агробактериальной трансформации
3.2. Анализ трансформированных растений
3.3. Морфологические особенности трансгенных растений
3.4. Изучение наследования встроенных генов
3.5. Анализ транскрипции введенных генов.
3.6. Анализ устойчивости трансгенных растений пшеницы в условиях корневого затопления.
3.6.1. Создание условий корневого затопления
3.6.2. Анализ воздействия корневого затопления на рост и развитие растений
3.6.3. Активность антиоксидантной энзиматической системы в растениях пшеницы в условиях корневого затопления.
3.7. Изучение морфогенетического потенциала каллусных линий,
полученных от трансгенных растений пшеницы с геном I
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Было показано, что при корневом затоплении кукурузы в первую очередь страдает главный корень, но продолжают развиваться придаточные корни, отходящие от нижней части стебля Гринева и Брагина, . В условиях затопления корни утолщаются и теряют корневые волоски Гринева и др. Изменяется направление роста, то есть корни начинают проявлять аэротропизм. Приспособительное значение этого явления очевидно корни растут ближе к поверхности воды, вследствие чего улучшается их снабжение кислородом. Известно, что после образования придаточных корней надземная часть растения начинает лучше расти и развиваться vvi v , . Влияние переувлажнения на надземные органы растений осуществляется опосредованно через нарушение кооперативных связей с корневой системой. У большинства видов недостаток кислорода в ризосфере вызывает ингибирование ростовых процессов. В ряде работ Гринева и др. Чиркова и Белоногова, было показано, что затопление снижаловысоту и массу растений пшеницы и кукурузы. Хотя по данным других авторов , сухая масса побегов пшеницы увеличивалась по сравнению с контролем в связи с нарушением оттока фотоассимилятов. Затопление вызывает изменения в строении тканей побегов. В первую очередь происходит разрастание базальной части стебля, что обеспечивает закладку дополнительных придаточных корней и проводящих пучков. У большинства растений, независимо от устойчивости, при затоплении возрастает общий объем газовых полостей . Затопление резко ускоряет старение растений, что было показано у табака, томата, подсолнечника, моркови, ячменя, гороха, пшеницы, кукурузы и сои , i, , , i . V i . Причинами раннего старения могут быть недостаток микро и макроэлементов, цитокинииа, поскольку этот гормон синтезируется в кончиках корней, а также гиббереллинов, закрытие устьиц, накопление этанола и этилена, токсические концентрации фосфора и восстановленных соединений , . В свою очередь, ускоренное старение ведет к преждевременному опадению листьев, цветков и плодов . Затопление уменьшает фиксацию азота у бобовых растений в результате уменьшения кислородного снабжения клубеньков, а также процесс нитрификации , . Степень устойчивости культур к избытку влаги в почве меняется в зависимости от фазы развития. Такой фактор, как температура почвы тоже оказывает существенное влияние на способности растений переживать гипоксию. Повреждения при более высокой температуре ИС наступает быстрее, чем при более низкой С , . По потребности в воде различают несколько категорий растений. Гидрофиты греч. К данной категории относятся следующие растения элодея, рдест, кубышка, кувшинка. Гигрофиты греч. Мезофиты греч. Это травянистые растения лугов и лесов, деревья и кустарники умеренного и влажного климата, а также большинство культурных растений. Мезофиты имеют различные приспособления, позволяющие им переносить кратковременное затопление, но в целом они страдают от избыточного увлажнения. Ксерофиты греч. Большинство растений, используемых в сельском хозяйстве, мезофиты и даже кратковременный анаэробиоз не проходит бесследно для их развития. Например, затопление почвы в течение 2 дней уменьшало урожай сои на у растений, находящихся в поздней вегетативной фазе, и на у растений в ранней репродуктивной фазе . Пшеница также относится к растениям, нормальное развитие которых сильно ограничено при воздействии анаэробного стресса. Так даже наиболее устойчивые к затоплению сорта пшеницы использовали проростки в возрасте 1 месяца теряли до 6 в сухой массе колоса после трех дней затопления и до после затопления в течение недели, когда уровень воды над поверхностью почвы не превышал мм vi i, . Таким образом, создание устойчивых к анаэробному стрессу сельскохозяйственных культур, может увеличить экономическую эффективность сельского хозяйства в местах, подверженных постоянному или временному переувлажнению.