Молекулярные и цитологические аспекты участия пролактина в регуляции созревания ооцитов коров

• Автор: Мормышев, Александр Николаевич
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.13
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: п. Дубровицы Московской обл.
• Количество страниц: 131 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Созревание ооцитов в яичниках млекопитающих

1.1.1. Ранние стадии оогеиеза и поддержание блока мейоза

1.1.2. Созревание овариальных фолликулов, сопряженное с ростом ооцитов

1.1.3. Ядерноцитоплазматические изменения при созревании ооцитов

1.1.4. Молекулярные факторы, регулирующие рсинициацшо мейоза

1.1.5. Взаимодействие ооцита и соматических клеток фолликула

1.2. Гормональный контроль созревания ооцитов млекопитающих

1.2.1. Ключевая роль гонадотропных гормонов в регуляции завершающих стадий фолликуло и оогенеза
1.2.2. Регуляторное влияние иролакхина на функциональную активность половых и соматических клеток антральных фолликулов
1.3. Механизмы реализации действия пролактина на клеткимншени
1.3.1. Характеристика рецептора пролактина
1.3.2. Внутриклеточные пути передачи сигнала пролактина
1.4. Современные технологии культивирования и оплодотворения i vi ооцитов коров
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Материалы
2.1.1. Объект исследования
2.1.2. Реактивы и оборудование
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение клеток гранулезы и их подготовка для ОТПЦР
2.2.2. Выделение желтого тела
2.2.3. Выделение и морфологическая оценка ооциткумулюсных комплексов
2.2.4. Изоляция денудированных ооцитов и клеток кумулюса
2.2.5. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора прол актина
2.2.5.1. Выделение тотальной РНК из овариальных клеток
2.2.5.2. Синтез первой цепи комплементарной ДНК
2.2.5.3. Метод полимеразной цепной реакции
2.2.6. Культивирование ооциткумулюсных комплексов и денудированных ооцитов
2.2.7. Морфофункциональная характеристика клеток кумулюса
2.2.8. Оплодотворение ооцитов и культивирование эмбрионов
2.2.9. Цитогенетический анализ ооцитов, зигот и эмбрионов
2.2 Статистическая обработка данных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1. Анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформы рецептора пролактина в ооцитах п клетках кумулюса коров
3.2. Характеристика влияния пролактина i vi на цАМФ зависимый механизм регуляции мейоза ооцитов коров
3.2.1. Оценка концентрационной зависимости ингибиторных эффектов дибутирил цАМФ и форсколина на ядерное
созревание ооцитов
3.2.2. Анализ ядерного созревания ооцитов в присутствии пролактина и цАМФповышающих реагентов
3.2.2.1. Культивирование ооциткумулюсных комплексов
3.2.2.2. Культивирование денудированных ооцитов
3.2.3. Изучение совместного влияния пролактина и цАМФ
повышающих реагентов на реинициацию мейоза
3.2.3.1. Сравнительное исследование возобновления мейоза в денудированных и окруженных кумулюсом ооцитах
3.2.3.2. Анализ участия протеинкиназы С в реализации мейозрегулирующего действия пролактина
3.3. Морфофункциональная характеристика соматических клеток при культивировании ооциткумулюсных комплексов в
среде, содержащей пролактин и цАМФповытающие реагенты
3.4. Оценка оплодогворяемости и способности к развитию ооцитов, созревших i vi в присутствии г онадотропных гормонов и пролактина
4. ОБСУЖДЕНИЕ ВЫВОДЫ
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Л1 анафаза
ВСА бычий сывороточный альбумин дбцАМФ дибутирильное производное цАМФ Дк диакинез
ДНК дезоксирибонуклеиновая кислота
сЫТР дезоксинуклеотидтрифосфаты
ДО денудированные ооциты
Дп диплотена
кДИК комплементарная ДК
К калпостин
КРС крупный рогатый скот
ЛГ лютеинизирующий гормон
МТ метафаза I
МП мегафаза II
ОКК ооциткумулюсные комплексы
ОТПЦР обратная транскрипция, совмещенная с полимеразной цепной реакцией
ПКА протеин киназа А ПКС протеинкиназа С п.о. пары оснований Г1РЛ пролактин
ПЦР полимеразная цепная реакция РНКрибонуклеиновая кислота
ТАР трисацетатЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
Т1 телофаза I
тотРНК тотальная РНК
ФБР фосфатный буферный раствор
ФБС фетальная бычья сыворотка
ФК форсколин
ФПС фактор промоции созревания ФСГ фолликулостимулирующий гормон ХГ хорионический гонадотропин цАМФ циклический аденозиимонофосфат
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Эго обусловливает необходимость легального изучения процессов, связанных с реализацией гормонального влияния на ооциты и кумулюсные клетки. Как известно, гонадотропные гормоны фолликулостимулирующий и лютеинизирующий играют ключевую роль в контроле овариальной функции млекопитающих. Также установлено, что основным вторичным посредником в механизмах передачи сигналов гонадотропных гормонов в фолликулярные клетки является циклический аденозинмонофосфат цАМФ, который выполняет центральную роль в регуляции мейоза ооцитов , 8. Одна из функций ПРЛ заключается в модуляции регуляторного действия гонадотропных гормонов на функциональную активность фолликулярных клеток, однако механизм этого модулирующего влияния до сих нор не ясен . В связи этим исследование взаимодействия сигнальных путей, активируемых гонадотропными гормонами, в первую очередь. АМФзависимого пути, и пролактином в ооциткумулюсных комплексах, имеет актуальное значение для понимания фундаментальных механизмов, лежащих в основе регуляции овариальной функции, в том числе созревания ооцитов. Цель настоящей работы идентифицировать молекулярные и клеточные пути влияния ПРЛ на созревание ооциткумулюсных комплексов коров и на этой основе модернизировать систему культивирования ооцитов для получения i vi эмбрионов крупного рогатого скота. Провести сравнительный анализ экспрессии мРНК длинной и короткой изоформ рецептора ПРЛ в ооцнтах и окружающих их клетках кумулюса. Исследовать участие клеток кумулюса в реализации эффектов ПРЛ на ядерное созревание ооцитов. Охарактеризовать роль протеинкииазы С в проведении сигналов ПРЛ в ооциты. Сравнить индивидуальное и совместное действие ПРЛ и цАМФповьтшаюцщх реагентов на морфофункциональное состояние клеток кумулюса. Изучить влияние ПРЛ в присутствии гонадотропных гормонов на созревание окруженных клетками кумулюса и денудированных ооцитов, их оплодотворяемость и способность к развитию до стадии бластоцисты. При выполнении диссертационной работы впервые выявлена экспрессия мРНК длинной и короткой формы рецептора ПРЛ в ооцитах и клетках кумулюса коров и показано функционирование как прямого, гак и опосредованного кумулюсом пути проведения сигнала ПРЛ в ооциты. Впервые детально исследовано взаимодействие сигнальных каскадов, активируемых цАМФ и иролактином в ооцитах и клетках кумулюса коров, и обнаружено различие участков сопряжения этих каскадов в половых и соматических клетках фолликулов. Выполненная работа является первым исследованием, в котором получены данные о зависимости характера влияния ПРЛ на мейоз от уровня цАМФ в ооцитах. Модернизирована система созревания i vi ооциткумулюсных комплексов из фолликулов диаметром мм посредством одновременного введения в среду гонадотропных гормонов и ПРЛ нгмл, обусловливающая повышение качества цитоплазматическою созревания ооцитов и эффективности получения эмбрионов крупного рогатого скота. У корой функционируют два разных пути проведения сигнала ПРЛ в социты прямой и опосредованный клетками кумулюса. Хара1сгер влияния ИРЛ на ядерное созревание ооцитов зависит от внутриклеточного уровня цАМФ. ПРЛ оказывает модулирующее действие на цАМФзависимый механизм регуляции мейоза в ооцитах коров. Модификация среды культивирования ооциткумулюсных комплексов, содержащей гонадотропные гормоны, введением ПРЛ нгмл позволяет оптимизировать условия созревания ооцитов коров и повысить последующий выход эмбрионов на стадии бластоцисты. Материалы диссертации были представлены на международных научных конференциях Актуальные проблемы биологии воспроизводства животных, Дубровицы, Современные достижения и проблемы биотехнологии сельскохозяйственных животных роль нанотехнологий в реализации приоритетных задач биотехнологии, Дубровицы, Новые аспекты биотехнологии репродукции животных, СанктПетербург, на конференциях Центра биотехнологии и молекулярной диагностики ВИЖа, , . По материалам диссертации опубликовано 5 научных работ, из них 2 в журналах, входящих в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий, рекомендованных ВАК. Список литературы включает 8 источников, в том числе 2 на иностранном языке.