Репликационный белок RC плазмиды pNB2 термофильных бактерий Clostridium thermosaccharolyticum : Идентификация, экспрессия и мутационный анализ

• Автор: Давыдова, Екатерина Евгеньевна
• Шифр специальности: 03.00.23, 03.00.04
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 122 с.

ОГЛАВЛЕНИЕ

Список сокращений.

ВВЕДЕНИЕ

I. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Механизм репликации i i

1.2 Использование системы стабильный токсинлабильный антитоксин для поддержания плазмид в клетках бактерий.

1.3 Экспрессия рекомбинантных генов в . i. Особенности работы с токсичными генами

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

II. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.

III. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ.

III. 1 Анализ нуклеотидной последовательности 2.

1.2 Измерение промоторной активности фрагментов плазмиды 2
1.3 Анализ аминокислотной последовательности белка,
соответствующего ОРС9.
1.4 Регистрация однонитевой формы плазмиды 2 в клетках
ii i.
1.5 Экспрессия гена.
1.5.1 Модификация не эффективных не инициирующих кодонов
гена.
III.5.2. Экспрессия гена в бесклеточной системе трансляции
транскрипции
1.5.3 Создание рекомбинантной плазмиды для соэкспрессии
редкой в .i тРНК
1.5.4 Трансформация клеток .i рекомбинантными плазмидами,
содержащим и ген.
1.5.5 Экспрессия гена i viv в .i
III.6. Очистка белка из лизатов .i
1.6.1 Модификация 5 конца гена последовательностью,
соответствующей шести гистидинам
III.6.2 Экспрессия гена, модифицированного последовательностью
соответствующей шести гистидинам
Ш.6.3 Очистка i белка из нерастворимой фракции
III.6.4 Подбор условий для увеличения растворимости белка i viv
III.7. Изучение причин летального действия белка на клетки . i
1.7.1 Сайтнаправленный мутагенез аминокислот, характерных для активного
центра релаксаз.
1.7.2 Делеционное картирование области белка, ответственной за его
летальное действие
ВЫВОДЫ.
Список литературы


В последние годы выделен ряд плазмид из термофильных и гипертермофильных организмов, и их изучение представляет особенный интерес в области знаний о природе термофильности. Так авторы , сообщают о выявлении в i плазмиды 1, предположительно кодирующей белок инициации репликации по механизму, а в гипертермофильных бактериях обнаружена плазмида 7 . Еще одна плазмида 5 выделена авторами из гипертермофильных архебактерий i. Специфический ii на двухтяжевой форме ДНК, так называемый ii . Ген белка, инициирующего репликацию на гер ген. Рис. Репликация по механизму. белок связывается со специфической последовательностью 2 белок производит однотяжевый разрыв на и связывается с 5 концом нити ДНК фосфодиэфирной связью, в то время как 3 конец служит праймером для синтеза ДНК с использованием интактной цепи как матрицы 3 в результате полного цикла элонгации одна из цепей ДНК полностью вытесняется вновь синтезированной, белок вторично узнает в замещенной цени определенную терминирующую последовательность в районе и производит еще один разрыв с одновременным воссоединением концов однотяжевой ДНК 4 образованная на предыдущем этапе однотяжевая форма плазмиды ДНК содержит специфическую область , на которой хозяйская РПКпраймаза создает РНКзатравку для работы ДНКполимеразы 6 после прохождения полного цикла элонгации на ДНК бактериальная ДНКполимераза узнает определенную последовательность в районе , и происходит обрыв полимеризации с образованием двухтяжевой ДИК ДНК. ii на однотяжевой форме ДНК, так называемый i ii , служащий сайтом инициации репликации с использованием ферментной системы клеткихозяина. На рисунке 1 представлена общая схема репликации. репликация инициируется при связывании белка со специфической последовательностью рис. Так как белок обладает топоизомеразной активностью Iтипа, он производит однотяжевый разрыв на и связывается с 5 концом нити ДНК фосфодиэфирной связью. С освобождением 3 конца цепи ДНК бактериальные ферменты запускают ДНК синтез в направлении от 3 к 5 концу с использованием интактной цепи как матрицы рис. В результате полного цикла элонгации одна из цепей ДНК полностью вытесняется вновь синтезированной, белок вторично узнает в замещенной цени определенную терминирующую последовательность в районе и производит еще один разрыв с одновременным воссоединением концов однотяжевой ДНК рис. Образуемая на этом этапе однотяжевая форма плазмиды ДНК содержит специфическую область рис. РНКпраймаза создает РНКзатравку для работы ДНКполимеразы рис. После прохождения полного цикла элонгации на ДНК бактериальная ДНКполимераза узнает определенную последовательность в районе , и происходит обрыв полимеризации с образованием двухтяжевой ДНК ДНК рис. На основании гомологии белков и среди различных плазмид были выявлены пять семейств плазмид. Неполный список членов этих семейств приведен в таблице 1. Плазмиды, не принадлежащие ни к одному из этих семейств, приведены в таблице 1 иод заголовком другие плазмиды. Некоторые из них имеют между собой гомологии, что может указывать на существование других, не выявленных пока семейств плазмид . Так выделенные недавно из грамотрицательных бактерий плазмиды и , не принадлежащие ни к одному из известных семейств, имеют много общего в организации генов, аминокислотной последовательности белков и структуре никсайта, что позволяет выделить их в новое семейство плазмид. Таблица 1. Плазмиды реплицирующиеся механизму . Семейство рТ1 рГ 1 рС1 4. С3 4. 7 4. 2 4. 2. 3. 4 2. 7 4. I 4. 2. Семейство 4 4 3. 2. 8. I1 2. X2 2. 1. V8 5. 2. V 3. Семейство 40 4 2. 9. 6. 1. 4. 4 5. 2 2. i 2. 2. 6. 2. 5. 8. 5 3. 2. 2. 3. 3 3. 2.