Получение и изучение свойств высокоочищенной циклодекстринглюканотрансферазы из Bacillus sp. 1070, модифицированных β-циклодекстринов и комплексов включения на их основе

• Автор: Волкова, Дарья Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2000
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 103 с. : ил.

Содержание
ВВЕДЕНИЕ.

ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1 Бактериальные циклодекстринглюканотрансферазы. Продуценты.

1.2 Свойства бактериальных ЦГТаз.

1.2.1. Физикохимические свойства бактериальных ЦГТаз

1.2.2. Структура бактериальных ЦГТаз

1.3 Методы выделения и очистки ЦГТаз.

1.3.1 Методы получения аффинных сорбентов с использованием ЦД.

1.3.2. Металлохелат аффинная хроматография как один из методов очистки ЦГТаз

1.4 Получение циклодекстринов.

1.4.1. Строение циклодекстринов
1.4.2. Модификация циклодекстринов.
1.5 Применение циклодекстринов
1.5.1 Применение модифицированных и немодифицированных циклодекстринов.
1.5.2 Циклодекстрины как модели ферментов
1.5.3 Применение циклодекстринов в хиральной хроматорафии.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
2.1 Материалы и объекты исследования
2.2. Общие методы исследования
2.3. Культивирование i .
2.4. Определение активности ферментов.
2.5. Определение физикохимических параметров ЦГТазы
2.6. Хроматографические методы очистки ЦГТазы
2.6.1. Гидрофобная хроматография ГХ
2.6.2. Ионообменная хроматография ИОХ
2.6.3. Металлохелат аффинная хроматография МХАХ
2.6.4. Синтез аффинных сорбентов а и 3ЦД сефароза 4В. .
2.6.5. Аффинная хроматография.
2.7. Комплексы включения с модифицированным РЦД .
2.7.1. Получение эпихлоргидринового полимера рциклодекстрина РЦДЭ.
2.7.2. Получение коньюгатов рЦДхитозан
2.8. Математическая обработка результатов экспиримента.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1. Скрининг микроорганизмов рода i с целью отбора штамма, обладающего максимальной активностью 3ЦГТазы.
3.2. Разработка способов выделения и очистки циклодекстринглюканотрансферазы из i .
3.2.1. Подбор условий первичной очистки ЦГТазы
3.2.2. Методы концентрирования культуральной жидкости, содержащей ЦГТазу
3.2.3. Разработка хроматографических приемов очистки
ЦГТ азы.
3.3. Определение физикохимических свойств очищенного фермента
3.3.1. Определение изоэлектрической точки ЦГТазы
3.3.2. Определение оптимума ЦГТазы.
3.3.3. Определение стабильности ЦГТазы.
3.3.4. Определение температурного оптимума ЦГТазы.
3.3.5. Определение температурной стабильности ЦГТазы
3.3.6. Влияние ионов металлов и ЭДТА на активность ЦГТазы.
3.4. Гидролиз крахмала очищенной ЦГТазой с целью получения рЦД.
3.5. Получение комплексов включений с Рциклодекстрином
3.5.1. Изучение влияния сополимера циклодекстрина с эпихлоргидрином на растворимость кортексолона
3.5.2. Исследование влияния коньюгата рциклодекстрин хитозан на растворимость гидрокортизона.
БЛАГОДАРНОСТЬ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Для решения этих задач необходимо продолжать активный поиск новых продуцентов ЦГТаз, разрабатывать рациональные схемы выделения и очистки специфических ЦГТаз, определять их физикохимические параметры, а также работать над совершенствованием технологии получения ЦД. Среди лабораторных методов очистки, фракционирования и анализа структуры белков совокупность хроматографических методов представляет собой наиболее эффективные и перспективные приемы получения высокоочищенных биологических препаратов, в том числе и ферментов. Также, в связи с тем, что с каждым годом области применения циклодекстринов расширяются, актуальным представляется поиск возможностей создания с этими циклическими молекулами новых комплексов включения, в частности с лекарственными препаратами стероидной природы. Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы явилась разработка рациональной схемы выделения и очистки циклодекстринглюканотрансферазы, изучение ее свойств, получение модифицированных рциклодекстринов и комплексов включения на их основе. ЦГТазы из i . РЦД. Научная новизна. ЦГТазы из i . Определены основные физикохимические характеристики ее ферментативной активности. Разработана модельная схема получения РЦЦ с помощью выделенного фермента рЦГТазы и впервые продемонстрировано, что содержание целевого продукта рЦЦ при гидролизе субстрата очищенной ЦГТазой в отсутствии других амилолитических ферментов а и рамилазы, пуллуланазы, глюкоамилазы составляет около . Причем общая степень конверсии субстрата оказалась не ниже . Синтезированы полимерные производные РЦД, полученного по предложенной схеме сополимер рЦД с эпихлоргидрином и коньюгат рЦЦ с низкомолекулярным хитозаном. Показано улучшение растворимости лекарственных препаратов стероидной природы в присутствии этих производных по сравнению с не модифицированным РЦЦ. Возможно применение этих производных для интенсификации процесса биотрансформации стероидов. Практическая ценность работы. Установлено, что разработанные хроматографические схемы очистки рЦГТазы просты в исполнении и эффективны, поскольку исключают некоторые нетехнологичные стадии, часто используемые при ее получении. Для выделенной ЦГТазы определены основные физикохимические характеристики ее ферментативной активности и подобраны оптимальные условия проведения гидролиза крахмала с целью получения рцд. Получен акт о наработке в лабораторных условиях очищенного фермента циклодекстринглюканотрансферазы из i . Апробация работы. Мекцународной конференции Биокатал из Москва, МГУ, . Публикации. По результатам исследования опубликовано 2 тезиса и 3 статьи, в которых отражены основные положения диссертации. Бактериальные циклодекстринглюканотрансферазы. Продуценты. Циклодекстринглюканотрансферазы продуцируются бактериями различных видов, преимущественно аэробными мезофильными бактериями, такими как i 14, i . В. i 7, В. i i , аэробными термофилами В. i , аэробными алкалофильными культурами В. i . В. ii . В таблице 1 представлены наиболее распространенные бациллярные продуценты ЦГТаз. Большинство микроорганизмов синтезируют внеклеточные ЦГТазы и различаются по количеству и типу продуцируемых ЦД. Впервые способность к синтезу ЦГТазы была обнаружена у культуры i австрийским ученым Ф. Шардингером в г. С этой культурой работали Де Пинто и Кэмпбелл, выращивая ее на среде с добавлением овсяных хлопьев и СаС, причем ЦГТаза продолжала продуцироваться микроорганизмом и после достижения стационарной фазы роста между 88 часами культивирования 6. В дальнейшем время ферментации было уменьшено до часов, благодаря оптимизации состава среды и условий выращивания. В ходе культивирования В. ЦГТазная активность наблюдалась на час роста. При проведении исследований с культурой В. ЦГТазной активности отмечалось на час культивирования, причем при дальнейшем выращивании уровень активности в культуральной жидкости в течение 23 суток практически не изменялся.