Разработка энантиоселективных биокатализаторов парциального ацилирования спиртов

• Автор: Мубараков, Артур Ильфатович
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2002
• Место защиты: Уфа
• Количество страниц: 130 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
СОДЕРЖАНИЕ.
ВВЕДЕНИЕ

1 ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР.

1.1 Потенциал микроорганизмов продуцентов липаз и карбоксил эстераз в энантиоселективном биокатализе.

1.1.1 Скрининг липолитических микроорганизмов

1Л .2 Биосинтез липолитических ферментов.

1.2 Ферменты в органических растворителях .

1.2.1 Влияние .

1.2.2 Состояние фермента.

1.2.3 Выбор растворителя.

1.3 Биокатализ целыми клетками микроорганизмов в органической среде
1.3.1 Токсичность растворителя.
1.3.2 Адаптация клеток в органическом растворителе.
1.4 Синтез сложных эфиров
1.5. Синтез карбоксильных амидов.
1.5.1. Сложные карбокиэфиры как ацильные доноры
1.5.2. Карбоксикислоты как ацильные доноры.
1.5.3. Энантиоселективный аминолиз.
1.5.3.1 Разделение доноров ацильной группы.
1.5.3.2. Разделение хиральных аминов.
2. ОБЪЕКТЫ, МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1 Объекты исследования.
2.2 Материалы исследования.
2.2.1 Синтез модельных соединений
2.2.1.2 Синтез оксима бутанона2.
2.2.1.3 Синтез 2аминобутана.
2.2.1.4 Синтез оптически активных соединений.
2.2.1.5 Синтез гераниолацетата путем этерификации
2.3 Методы исследования
2.3.1 Культивирование микроорганизмов
2.3.2 Получение накопительных культур
2.3.3 Выделение чистых культур микроорганизмов.
2.3.4 Хранение микроорганизмов.
2.3.5 Идентификация микроорганизмов
2.3.6 Обработка биомассы ацетоном
2.3.7 Трансформация соединений покоящимися клетками микроорганизмов
2.3.8 Трансформация соединений обработанной ацетоном биомассой.
2.3.9 Определение концентрации белка и биомассы
2.3. Определение эстеразной активности.
2.3. Определение концентрации субстратов и продуктов трансформации
2.3. Идентификация продуктов трансформации кетосодержащих соединений.
2.3. Определение оптической чистоты продуктов биотрансформации.
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
3.1 Скрининг микроорганизмов с эстеразной активностью
3.1.1 Выделение и экспресстестирование микроорганизмов обладающих эстеразной активностью.
3.1.2 Количественная оценка гидролазной активности выделенных микроорганизмов
3.1.3 Поиск биокатализаторов среди музейных липолитических
микроорганизмов
3.2 Скрининг ацилирующей активности у микроорганизмов
3.2.1 Разработка экспрессметода для тестирования микроорганизмов на наличие ацилирующей активности.
3.2.2 Экспресстестирование ацилирующей активности у микроорганизмов
3.3 Поиск микроорганизмов потенциальных продуцентов энантиоселективных ацилирующих ферментов.
3.3.1 Исследование кинетики ацилирования гептанола2 винилацетатом в условиях экспрессметода.
3.3.2 Исследование зависимости степени конверсии субстрата от его начальной концентрации.
3.4 Исследование условий роста микроорганизмов и синтеза ферментов, ответственных за трансформацию вторичных спиртов.
3.5 Разработка биокатализаторов ацилирования на основе клеток микроорганизмов
3.5.1 Исследование влияния обезвоженной ацетоном биомассы на гидролазную и ацилирующую активность клеток
3.5.2 Принципиальная схема получения биокатализаторов парциального ацилирования спиртов.
3.6 Исследование стабильности биокатализатора при длительном хранении.
3.7 Исследование условий ацилирования гептанола2 обезвоженными клетками.
3.7.1 Исследование влияния температуры на ацилирование гептанола
3.7.2 Влияние природы органического растворителя на ацилирование гептанола
3.8 Исследование этерификации гептанола
органическими кислотами
3.9 Исследование стабильности биокатализаторов в процессе
ацилирования
ЗЛО Идентификация перспективных штаммов и исследование патогенных свойств
3. Разработка метода кинетического разделения гептанола2.
3. Разработка метода разделения рацемического пентанола2.
3. Разработка метода кинетического разделения 2,3ДИхлорпропанола
3. Трансформация азотсодержащих органических соединений
Трансформация 2аминобутама.
Ацилирование оксима бутанона2 винилацетатом, катализируемое обезвоженными ацетоном клетками микроорганизмов
Трансформация ЫЗЕпентен2илортотолуидина.
3. Разработка методов синтеза эфиров гераниола.
3. Ферментативный синтез эфиров глицерина
ВЫВОДЫиз
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ ИСТОЧНИКОВ


Трансформация 2аминобутама. Трансформация ЫЗЕпентен2илортотолуидина. Разработка методов синтеза эфиров гераниола. Важнейшим преимуществом интактных клеток как биокатализаторов в реакциях гидролиза перед ферментными препаратами может являться возможность их регенерации и многократного использования. Особенно эффективным может оказаться использование клеток липолитических микроорганизмов в парциальном ацилировании рацемических спиртов. Известно, что проведение эффективного ацилирования в водной среде невозможно, поскольку присутствие воды в системе смещает равновесие липолитической реакции в сторону гидролиза 3. Поэтому приходится проводить реакцию в органическом растворителе, оказывающем дестабилизирующее действие на ферменты 4. Для сохранения активности липазы в органическом растворителе требуется ее химическая модификация, иммобилизация на инертном носителе или включение в гидратированные обращенные мицеллы поверхностноактивного вещества. Одним из вариантов защиты фермента от инактивирующего действия органического растворителя может служить естественная локализация фермента внутри клеток или переплазматическом пространстве. В связи с этим особенно актуальной является задача поиска новых эффективных и стабильных биокатализаторов для ферментативного асимметрического синтеза вторичных спиртов, а также их эфиров, обладающих широкой субстратной специфичностью и осуществляющих биотрансформацию со 0 химическим и энантиоселективным выходом. Федеральной целевой программой Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки гг. Научные исследования Высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники гг. Цель работы. Разработка биокатализаторов энантиоселективного ацилирования рацемических спиртов на основе микроорганизмов, обладающих карбоксилэстеразной активностью, и создание методов получения оптически активных спиртов и эфиров. Научная новизна. Найдены и идентифицированы новые штаммы . Определены оптимальные параметры выращивания биомассы, найдены условия, в которых биокатализаторы проявляют наивысшую активность. Впервые предложен метод использования внутриклеточных ферментов для осуществления эффективного катализа реакций парциального ацилирования спиртов в неводных средах путем обезвоживания клеток ацетоном. Доказана повышенная стабильность и возможность многократного использования разработанных биокатализаторов. Практическая значимость. Разработаны высокостереоселективные биокатализаторы на основе штаммов i . Созданы препаративные методы получения 5гептанола2, Кгептанола2, 8пентанола2, пентанола2, 2,3дихлорпропанола высокой оптической чистоты 0 ее, которые являются оптически активными синтонами при получении различных низкомолекулярных биорегуляторов феромонов насекомых, 3адренергетиков, цереброзидов, гормонов. Методика разделения рацемических спиртов гептанола2 и пентанола2 используется в учебном процессе УГНТУ при подготовке специалистов по специальности Биотехнология. Апробация работы. Результаты исследований докладывались на второй Международной конференции Актуальные тенденции в органическом синтезе на пороге новой эры СанктПетербург, июнь г. V Международной конференции по интенсификации нефтехимических процессов Нефтехимия Нижнекамск, сентябрь г. XXXVII Международной научной студенческой конференции Новосибирск, апрель г. Уфа, апрель Международной научнопрактической конференции Сервис большого города Уфа, май г. Реактив, УфаМосква, сентябрь г. И.П. Павлов и современные проблемы биологии и медицины Уфа, октябрь г. Биотехнология ФЦП Интеграция Санкт Петербург, июнь г. XXXVIII Международной научной студенческой конференции Новосибирск, г. XIII Международной конференции по производству и применению химических реактивов и реагентов Реактив УфаМосква, ХХХХ1Х Международной научной студенческой конференции Новосибирск, г. XIX Международной конференции по производству и применению химических реактивов и реагентов Реактив УфаМосква, г. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи и тезисы докладов.