Характеристика линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы, в переносе экзогенной ДНК в клетки млекопитающих

• Автор: Абдрахманов, Игорь Камильевич
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Дубровицы
• Количество страниц: 101 с. : ил

Содержание

Список сокращений

Введение

1.ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Методы генетической трансформации клеток

1.2. Жизненный цикл и строение ретровирусов

1.3. Ретровирусные векторы

1.3.1. Векторы для одиночных генов

1.3.2. Векторы для спаренных генов

1.3.3. Самоинактивнрующиеся векторы

1.4. Клетки, упаковывающие рекомбинантный ретровирусный

векгор
1.5. Методы получения трансгенных животных
1.6. Использование ретровирусных векторов в получении
трансгенных животных
1.7. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
2.1. Линии клетокмишеней
2.2. Линии клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный векгор
2.2.1. Происхождение рекомбинантных ретровирусных векторов
2.3. Культуральная посуда
2.4. Культуральные среды, растворы и реактивы
2.4.1. Ростовые среды
2.4.2. Специальные среды и растворы
2.5. Приборы и оборудование
2.6. Культивирование клеток и их хранение
2.6.1. Оценка жизнеспособности клеток после оттаивания
2.7. Получение вирусных препаратов
2.8. Генетическая трансформация клетокмишеней
2.8.1. Трансфекция клеток с помощью вирусных препаратов
2.8.2. Трансфекция клеток путем совместного культивирования
2.9. Введение ретровирусных векторов в организм животных
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Характеристика морфофизиологических особенностей линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы
3.2. Введение экзогенной ДНК в геном клетокмишеней
3.2.1. Морфофизиологическая характеристика клетокмишеней
3.2.2. Подбор селективных условий
3.2.3. Тестирование рекомбинантных ретровирусных векторов в культуре клеток млекопитающих
3.2.3.1. Характеристика линии клеток АМ, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный вектор , в переносе экзогенной ДНК в клеткимишени
3.2.3.2. Характеристика линии клеток АМ, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный вектор , в переносе экзогенной ДНК в клеткимишени
3.2.3.3. Характеристика линии клеток АМ, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный вектор , в переносе экзогенной ДНК в клеткимишени
3.2.3.4. Характеристика линии клеток РТ, упаковывающих рекомбинантный ретровирусный вектор X2 в переносе экзогенной ДНК в клеткимишени
3.3. Сравнительный анализ потенций линий клетокупаковщиц в переносе экзогенной ДНК в клеткимишени
3.4. Сравнительный анализ эффективности методов переноса рекомбинантного ретровируса для получения стабильных генетически трансформированных клонов клеток млекопитающих
3.5. Молекулярный анализ наличия ДНК рекомбинантных ретро
вирусов в клеткахмишенях
3.6. Введение экзогенной ДНК в организм животных
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Интенсивность развития животноводства на современном этапе во многом зависит от разработки новых биотехнологических приемов направленных на реконструирование генома сельскохозяйственных животных. Работы по реконструированию организма животных ведутся в различных направлениях, одним из которых является получение животных со стабильной интеграцией и экспрессией экзогенной ДНК в геноме трансгенные животные . Обусловленные переносом генов такие специфические изменения генома млекопитающих имеют большое значение в сравнительной эмбриологии, биологии развития, медицине и биотехнологии. Трансгенные животные могут использоваться как модели для изучения болезней человека и животных, в генной терапии, для улучшения физиологических свойств и признаков продуктивности домашних животных. Коммерческий интерес такие животные представляют в качестве источников ценнейших фармакологических эритропоэтин, интерферон, альбумин, факторы свертывания крови й др. Важным является создание животных, у которых в результате проведения геномных манипуляций организм приобретает устойчивость к инфекциям. В этой связи особенно актуальным считается применение рекомбинантных конструкций, содержащих антисмысловые Р1ПС вирусных генов. Введение таких рекомбинантных последовательностей в организм сельскохозяйственных животных с последующей их интеграцией позволило бы блокировать экспрессию вирусных генов на уровне транскрипции. Известно, что в некоторых случаях, интеграция рекомбинантной ДИК оказывает негативное воздействие на организм животного. Например, трансгенные животные, полученные инъекцией в пронуклеус рекомбинантных 1Ш ДНК гена эртрогюэгина, представляющего собой ценное фармакологическое средство, оказываются нежизнеспособными. Но направленная продукция такого белка в молоко сельскохозяйственных животных могла бы иметь огромный коммерческий интерес. Таких животных называют фенотипическими транс нами. Перенос генов в клетки животных возможен на различных стадиях эмбрионального и лостнатального роста организма. Анализ литературных данных показал, ттто в создании трансгенных животных широкое применение нашли несколько методических приемов ретровирусная трансфекция эмбрионов, микроиньекшя ДНК в пронуклеус, использование трансгенной спермы, в качестве вектора, и получение эмбриональных химер с помощью эмбриональных стволовых клеток ЭСК . Все эти методы пока эффективны на лабораторных животных. Следует заметить, что наиболее часто используемым методом для получения трансгенных сельскохозяйственных животных, до сих пор была мшфоишекция рекомбинантной ДНК в пронуклеус яйцеклетки. Однако данный метод далек от совершенства и имеет ряд недостатков трудоемкий, дорогостоящий и, самое главное, неэффективный . Более того, не встроившиеся в геном реципиента молекулы рекомбинант ных ДНК а при иньекции используются, как правило, их линейные формы подвергаются разрушению. Поэтому, большое значение приобретает способ доставки рекомбинантных конструкций в организм животных. В связи с этим во всем мире ведутся интенсивные исследования, направленные на разработку новых, эффективных методов переноса. Особенно актуальными на сегодняшний день являются исследования, проводимые на основе клеточной инженерии. Здесь возможно несколько методических подходов. Олин из них предполагает использование линий клеток, упаковывающих рекомбинантные ретровирусные векторы. Использование ретровирусов в качестве векторных молекул за последние годы обрело статус наиболее перспективного и универсального метода введения клонированных генов в эукариотические клетки и их экспрессии 5. Эго обусловлено несколькими причинами, одной из которых является высокая эффективность инфицировании пермиссивньгх клеток.