Выделение и характеристика примордиальных половых зародышевых клеток свиньи

• Автор: Приданцева, Татьяна Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: п. Дубровицы
• Количество страниц: 110 с. : ил

Содержание

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ

ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возникновение половых клеток у млекопитающих

1.2. Локализация, идентификация, миграция и пролиферация

ШК у млекопитающих

1.3. Механизмы миграции ППЗК к зачаткам гонад

1.4. Половые клетки в индифферентной закладке гонады

1.5. Смещенные зародышевые клетки половые клетки,

развивающиеся вне гонад

1.6. Морфологические особенности ППЗК
1.7. Гены, экспрессируемые ППЗК
1.8. Выделение ППЗК млекопитающих и культивирование т
i
1.9. Заключение
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ 4
2.1. Подготовка животных
2.2. Культуральная посуда
2.3. Культуральные среды, растворы и реактивы
2.3.1. Ростовые среды
2.3.2. Специальные среды и растворы
2.4. Приборы и оборудование
2.5. Приготовление фидерных слоев из перевиваемых эмбриональных фибробласгов мыши линии 8ТО
2.6. Приготовление фидерных слоев, представленных
первичными клетками Сертоли свинеи
2.7. Изготовление микроинструментов
2.8,Оценка жизнеспособности клеток в суспензии, полученной при выделении ППЗК из зачатков гонад зародьппей мыши
2.9. Идентификация ППЗК мыши и свиньи т vi
2.9.1 .Приготовление раствора фиксатора
2.9.2. Приготовление раствора красителя
2.9.3. Цитохимический тест на специфическую активность щелочной фосфатазы
2 Оценка колоний стволовых зародышевых клеток
21. Приготовление раствора красителя Гимза
22. Окрашивание колоний стволовых зародышевых клеток
3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Выделение примордиальных половых клеток из плодов мышей и их
очистка
3.1.1 .Сравнительный анализ эффективности механического и ферментативного способов обработки зачатков гонад плодов мышей
3.1.2. Разработка метода очистки ППЗК мышей от других клеточных типов
3.2. Изучение факторов, влияющих на выделение примордиальных половых клеток из плодов свиней
3.2.1. Изоляция ППЗК из зачатков гонад плодов свиней
3.2.2. Влияние возраста плодов свиньи на выделение ППЗК
3.2.3. Влияние пола плода свиньи на получение ППЗК
3.3. Характеристика свежеизолированных ППЗК свиньи
3.4. Оценка выживаемости ППЗК свиньи после криокоисервании
3.5. Культивирование ГТПЗК свиньи
3.5.1. Влияние различных монослоев соматических клеток на поддержание ППЗК свиньи в культуре
3.5.2. Влияние возраста плодов на получение колоний столовых половых клеток с морфологией ЭСК
3.5.3. Влияние ростовых факторов на культивирование ППЗК свиньи
3.6. Характеристика колоний предполагаемых стволовых зародышевых клеток, полученных при культивировании ППЗК свиньи
3.7. Получение колоний предполагаемых стволовых половых клеток
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Поразительное принципиальное сходство в поведении первичных половых клеток, которое существует между разными видами млекопитающих при небольшом разнообразии частных особенношей, подчеркивает ценность проведения сравнительных исследований с самыми различными видами животных и дает возможность оценивать те или иные факты, касающиеся изучения ППЗК, в свете эволюционной теории 9. В настоящее время в ведущих научноисследовательских институтах различных стран мира изучается множество аспектов проблемы, связанной с исследованием ППЗК млекопитающих, в том числе и человека . Актуальность этой проблемы отражается не только в теоретических дискуссиях, но и в постановке таких важных практических задач, как необходимость увеличения продуктивности животных, лечение бесплодия, регулирование рождаемости у людей и др. Выделение П3 из зачатков гонад млекопитающих с целью получения из них культур стволовых зародышевых клеток представляет собой одно из перспективных направлений в клеточной биологии, поскольку позволяет создать экспериментальные модели для изучения механизмов гаметогенеза у млекопитающих. Так как ПГК являются тотипотентными клетками, то они также i бьггь использованы как удобная модель i vi для изучения процессов цигодифференцировки в развитии млекопитающих . Достижения мировой и отечественной клеточной инженерии показали, что открывается возможность массового получения генетически идентичных особей сельскохозяйственных животных с выдающимися продуктивными качествами путем клонирования. Это даст возможность на порядок увеличить темпы генетического совершенствования племенных и товарных стад, создать товарные стада, животные в которых характеризуются меньшей изменчивостью продуктивных признаков, что дает возможность принципиально поновому решать сложнейшие взаимодействия организмов и механизмов, создать эффективные автоматизированные технологии производства . В связи с этим, альтернативным и перспективным подходом является использование ПГК млекопитающих а качестве неиссякаемого источника тотапотентных ядер при создании новых клеточных типов в процессе клонирования. В конце х годов целому ряду исследовательских институтов удалось выполнить клонирование животных путем пересадки ялср. Возможность клонирования млекопитающих путем трансплантации ядер бластомеров в энуклеированные ооциты была показана у крупного рогатого скота, овец и кроликов . Следует отметить, что степень успеха при клонировании всегда оставалась довольно низкой, и, кроме того, реклонирование повторное клонировшше эмбриона, полученного посредством пересадки ядер представляло собой большую трудность 2. В настоящее время ведутся успешные попытки использования ПГТЗК в качестве доноров ядер . В году в лаборатории фирмы Американская служба разведения , США под руководством i впервые удалось получить клонированного теленка по кличке Ген 3. Исходным материалом для клонирования послужили ядра ППЗК крупного рогатого скота, полученные из закладок женских гонад плода теленка в возрасте суток. По сравнению с опубликованным ранее сообщением Яна Вильмута и Кейта Кемпбелла 8 из Иститута Рослин в Шотландии о рождении овцы Долли, полученной из клеток эпителия молочной железы уже взрослой овны, эффективность клонирования ППЗК но всей вероятности значительно выше. В данном случае авторы сообщают о высокой эффективности нового методического подхода. Из ти пересадок ядер в энуклеированные яйцеклетки крупного рогатого скота была получена одна стельность, которая закончилась благополучно. Стволовые зародышевые клетки млекопитающих также могут использоваться как вектор для переноса рекомбинантной ДИК в организм животных. После введения ППЗК в гонады зародыша они способны принимать участие в формировании всех органов и тканей химерного организма, и поэтому являются удобным материалом для проведения геномных манипуляций у млекопитающих 3,8. Преимущество ППЗК перед клетками, выделенными из эмбриобласта зародышей млекопитающих, состоит в том, что они представляют собой единственные клетки, у которых стерты родительские отпечатки геномный импринтинг. Считается, что геномный импринтинг оказывает влияние на потенции ЗСК в формировании эмбриональных и внеэмбриональных структур зародышей млекопитающих .