Молекулярно-генетические аспекты использования ретровирусных векторов для трансгенеза в животноводстве

• Автор: Титова, Виктория Андреевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: п. Дубровицы
• Количество страниц: 120 с. : ил

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Ретровирусы как естественные векторы для переноса

экзогенных генов

У. У. 1. Строение вириона ретровирусов

1.1.2. Жизненный цикл ретровирусов

У. 1.3. Конструирование векторов на основе ретровирусов

1.2. Создание трансгенных животных путм трансформации

половых клеток самцов

1.3. Использование молочной железы для синтеза

рекомбинантных белков
1.3.1. Получение соматических трансгенных животных с
помощью ретровирусных векторов
1.3.2. роизводство рекомбинантных белков
1.3.2.1. Производство рекомбинантных белков фармакологического
назначения
1.3.2.2. Изменение состава и свойств молока 3
1.3.3. Животныепродуценты рекомбинантных белков
Экспрессия трансгенных белков
Экспрессия продуктов трансгенов в молоко
Экспрессия продуктов трансгенов в кровь
Исследование способности ретровирусных векторов переносить экзогенные конструкции в органы и ткани животных
МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА ИССЛЕДОВАНИЙ Реактивы и оборудование
Реактивы
Оборудование
Используемые векторные системы
Анализ животных на наличие рекомбинант ной вставки
Экстракция ДНК Определение концентрации ДНК
Использование полимеразной цепной реакции для проведения анализов на трапсгенностъ
Анализ экспрессии трансгенных белков
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ Опенка клетокупаковшиц на наличие рекомбинантной вставки
Разработка и оптимизация тестсистем
3.2.
3.2.2.
3.3.
3.3.3.
3.4.1.
3.5.
Оценка используемых клетокупаковщиц на наличие
рекомбинантной вставки
Оптимизация метода выделения ДНК из слюны и
Оптимизация выделения ДНК из слюны
Оптимизация выделения ДНК из спермы
Исследование способности ретровирусных векторов ДЛЯ
локального переноса генов в молочную железу, кровь и семенники животных
Исследование характера интеграции генной конструкции
при введении ретровирусных векторов в молочную железу Исследование характера интеграции при внутривенном
введении клетокупаковщиц, содержащих рекомбинантную ДНК
Оценка эффективности использования ретровирусных
векторов для переноса рекомбинантной генной конструкции в спермин i viv
Исследование экспрессии трансгенного белка
Исследование динамики экспрессии рекомбинантного
эритропоэтина в молоко свиноматок
Исследование динамики экспрессии рекомбинантного
эритропоэтина в молоко крупного рогатого скота Исследование распространения провируса в органах и
тканях при иньскшш ретровирусных векторов в
молочную железу
3.5.1. Исследование распространения провируса в органах и 8 о
тканях при инъекции ретровирусных векторов в молочную железу
3.5.2. Исследование распространения провируса в органах и
тканях животных при внутривенном введении ретровирусных векторов
3.5.3. Исследование распространения провируса в органах и
тканях при инъекции ретровирусных векторов в семенники
4. ОБСУЖДЕНИЕ
5. ВЫВОДЫ
6. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
7. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
8. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
Введение
Актуальность


Ранние работы были, в основном, сфокусированны на получении животных, несущих экзогены, отвечающие за рост и развитие, резистентность к заболеваниям, увеличение репродукции, изменение лактации, повышение эффективности переваривания кормов и улучшение иммунного ответа. В настоящее время, трансгенных животных используют в качестве моделей для исследования патогенеза различных наследственных и других заболеваний, для производства биологически активных белков для фармацевтической промышленности. Несмотря на то, что для создания трансгенных животных, в том числе и сельскохозяйственных, находит применение целый ряд методов инъекция в пронуклеус, липосомы и спермин как векторы, пересадка ядер, эффективность их получения остатся на довольно низком уровне. Кроме того, создание трансгенных сельскохозяйственных животных лимитируется высокими материальными и временными затратами. В этой связи возникает необходимость в поиске и разработке альтернативных подходов, позволяющих эффективно получать генетически модифицированных особей. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом ретровирусных векторов является возможность их использования для получения так называемых фенотипических трансгенных животных методами локального органного трансгенеза. В отличие от введения трансгена в эмбриональные линии, использование ретровирусных векторов для локального переноса экзогенных генов животным в постнатальный период позволяет синтезировать рекомбинантные продукты в отдельных органах уже через несколько месяцев или даже дней после начата эксперимента. Особенно актуальным это является для экспрессии рекомбинантных белков с молоком сельскохозяйственных животных свиней и коров, так как по сравнению с методом микроинъекции затраты времени от начала экспериментов и до получения первых результатов об уровне экспрессии в молоке сокращаются в раз. За последние десятилетия был разработан целый ряд методов, позволяющих вводить интересующие последовательности ДНК в клетки индивидуумов микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы, использование трансформированных первичных половых и эмбриональных стволовых клеток ЭСК, ретровирусных, аденовирусных и аденоассосиированных векторов, трансформированных спермиев и липосом. Микроинъекция ДНК в пронуклеус зиготы делает возможным введение и интеграцию в геном фрагментов ДНК длиной до пар нуклеотидов. Использование для получения трансгенных животных трансформированных ЭСК позволяет целенаправленно воздействовать на геном посредством генного таргетинга Савченкова И. П. и др. Зиновьева . . и др. Брем Г. . . i В . i . V. . . Введение экзогенных генов в молочную железу взрослых особей позволяет получать рекомбинантные белки интерфероны, эригропоэтин и др. Причм, по сравнению с традиционным методом микроинъекции ДНК в пронуклеус зиготы затраты времени от начала эксперимента до получения первых результатов об уровне экспрессии сокращаются с 45 лет до 45 месяцев. Однако каждый из этих методов имеет ряд недостатков, ограничивающих их использование . .. ДНК, не сайтспецифическая интеграция, хромосомные абберации Дыбан А. П., . Получение трансгеииых животных с помощью первичных половых клеток, эмбриональных стволовых клеток, трансформированных спермиев и ли носом также связано с определнными трудностями . i . ., . Так, при использовании зародышевых клеток, полученные особи в большинстве случаев являются химерными. Кроме того, лишь часть животных будут передавать трансген по наследству потомству Брем Г. В этой связи, с целью разработки оптимальной технологии локального трансгснеза, основанной на использовании ретровирусных векторных систем, актуальным является оценка эффективности отдельных методик для доставки ДИК в отдельные органы сельскохозяйственных животных, в частности в молочную железу свиней и коров. Цель и задачи исследования. Целью диссертационной работы является исследование способности ретровирусных векторов переносить генетическую информацию в органы и ткани сельскохозяйственных животных с использованием молекулярногенетических методов.