Исследование рекомбинантных штаммов Saccharomyces cerevisiae и разработка технологических приёмов глубокой переработки их биомассы

• Автор: Гордонова, Ирина Константиновна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2001
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 197 с. : ил

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ.

ВВЕДЕНИЕ

Глава 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ.

1.1. vii как объект получения рекомбинантных белков.

1.1.1. Технология экспрессии гетерологичных протеинов в . vii.

1.1.2. Влияние питательной среды на рост и продуктивность . vii

1.2. Основные сведения об эпидермальном факторе роста человека

1.2.1. Структура и механизм действия ЭФР

1.2.2. Физиологическая роль чЭФР и перспективы его использования

1.2.3. Биотехнологические способы получения чЭФР

1.3. Основные подходы к созданию безотходного производства
1.3.1. Основы комплексного использования vii.
1.3.2. Основные направления создания безотходных технологий.
1.4. Получение дрожжевых полисахаридов и их использование.
1.4.1. Открытие биологически активных полисахаридов.
1.4.2. Свойства зимозана
1.4.3. Механизмы действия полисахаридов . vii.
1.4.3.1. Механизмы активации макрофагов.
1.4.3.2. Механизм стимуляции гемопоэза
1.4.3.3. Усиление функциональной активности гранулоцитов
1.4.3.4. Стимуляция и регуляция Т и Влимфоцитов.
1.4.4. Способы получения зимозана.
1.4.5. Применение полисахаридов . vii.
1.5. Получение дрожжевой РНК и ее использование.
1.5.1. Препараты на основе РНК
1.5.2. Биологические эффекты и механизм действия дрожжевой РНК
1.5.3. Получение низкомолекулярной дрожжевой РНК.
1.5.4. Применение препаратов низкомолекулярной дрожжевой РНК.
Глава 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.
2.1. Культивирование различных штаммов в. сегеае
2.2. Получение ЭФРобогащенной фракции из культуральной жидкости
Б. сегеу1з1ае
2.3. Хроматографические методы очистки ЭФРобогащенной фракции
2.4. Получение полисахаридных препаратов из дрожжевых клеток
Б. сегеу1ае
2.5. Получение компонентов питательных сред
2.5.1. Получение препарата из культуральной жидкости Б. сегеуае.
2.5.2. Получение препарата из продуктов ферментативного гидролиза клеток Б. сегеае.
2.6. Получение препаратов РНК из препаратов ПФГ клеток Б. сегеу1з1ае
2.7. Определение подлинности полисахаридных препаратов.
2.7.1. Микроскопия.
2.7.2. Качественная реакция на мукополисахариды
2.8. Испытание суспендирующей способности полисахаридных препаратов.
2.9. Определение потери в весе при высушивании полисахаридных препаратов.
2 Качественное определение свободных моносахаров.
2 Гидролиз полисахаридных препаратов.
2 Качественный анализ структурных компонентов полисахаридных препаратов.
2 Количественное оределение моносахаров
2 Определение содержания восстанавливающих веществ в полисахаридных препаратах.
2 ИКспектроскопия.
2 Определение общего электроотрицательного азота в
полисахаридных препаратах
2 Определение биологической активности полисахаридных препаратов.
. Определение количества лейкоцитов в периферической крови
. Определение розеткообразующей способности лимфоцитов
. Оценка фагоцитарной активности гранулоцитов.
2 Определение серологической активности полисахаридных препаратов.
2 Дискэлектрофорез.
. Дискэлектрофорез препаратов чЭФР.
. Дискэлектрофорез препаратов РНК
2 Определение нуклеотидного состава препаратов РНК
2 Определение белка.
. Качественное определение
. Количественное определение по и
. Количественое определение по О.Н. .
2 Аминокислотный анализ.
2 Определение ДНК.
2 Определение РНК.
2 Определение свободных аминогрупп
2 Определение триптофана
2 Статистическая обработка результатов
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ.
Глава 3. Получение полисахаридных препаратов из клеток . vii
3.1. Разработка метода выделения полисахаридных препаратов
3.2. Изучение физикохимических и фармакологических свойств полисахаридных препаратов из рекомбинантных штаммов
3.3. Разработка тестсистем для дополнительной оценки иммуномодулирующей активности полисахаридных препаратов.
3.3.1. Тестсистема для изучения фагоцитарной активности гранулоцитов.
3.3.2. Тестсистема для изучения розеткообразующей способности
лимфоцитов
Глава 4. Получение препаратов РНК из технологических отходов,
образующихся при выделении полисахаридных препаратов
4.1. Разработка способа выделения РНК из препарата ПФГ.
4.2. Характеристика препаратов РНК из различных штаммов дрожжей
Глава 5. Повышение эффективности технологии получения ЭФР путм
использования технологических отходов в качестве компонентов питательных сред.
5.1. Получение и характеристика препаратов на основе культуральной жидкости рекомбинантных штаммов Б. сегеу1з1ае
5.2. Характеристика препаратов ПФГ из рекомбинантных штаммов
Э. сегеу1з1ае
5.3. Изучение основных закономерностей роста и синтеза чЭФР рекомбинантными штаммами в. сегеу1э1ае.
5.4. Использование препаратов КЖ при культивировании рекомбинантных штаммов
5.5. Использование препаратов ПФГ при культивировании рекомбинантных штаммов
Глава 6. ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ВЫВОДЫ.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Для экспрессии гетерологичных протеинов часто создаются специальные штаммы дрожжей с ауксотрофными маркерами для облегчения генетических манипуляций. При наличии мультикопийных плазмид, содержащих не только интересуемый гетерологичный ген, но и один или два ауксотрофных маркера, клеткам необходима специально созданная селективная среда для устойчивой экспрессии генов чужеродных протеинов в последующих генерациях 1. Кроме того, во время конструирования штаммы могут приобретать определенные мутации, создающие дополнительные трудности для роста на простой среде. Таким образом, в связи со специфическими требованиями к питанию генетически созданных штаммов и необходимостью в высоком уровне экспрессии рекомбинантных белков программа оптимизации питательной среды для рекомбинантных штаммов является неотъемлемым этапом биотехнологического процесса. Хорошо известно, что условия роста и состав питательной среды влияют на физиологические свойства Э. От углеродного источника и его концентрации зависит осуществляемый клетками путь метаболизма. Известно, что глюкоза подавляет катаболизм других сахаров, этанола, органических кислот катаболитная репрессия . Кроме того, высокая концентрация глюкозы в среде свыше 1 гл приводит к подавлению аэробного дыхания и активации спиртового брожения, что сопровождается снижением роста клеток 1. Известно, что почти все компоненты среды, в том числе микроэлементы, влияют на клеточный метаболизм 7. Установлено, что использование комплексной среды для биотехнологических целей может иметь ряд преимуществ по сравнению с минимальной средой. При культивировании штамма . В , на неселективной комплексной среде дрожжевой экстракт гидролизат сои декстроза , происходило увеличение биомассы в 3,5 раза, а продукции антигена в раз по сравнению с показателями на среде, не содержащей лейцина с известным химическим составом 3. В обогащенной комплексной среде секреция клетками . Однако, уровень е экспрессии оставался выше в синтетической среде, что, повидимому, связывается авторами с неселективностью богатой комплексной среды. Результаты работ по использованию среды с частично известным химическим составом также достаточно противоречивы. Применение синтетической комплексной среды синтетическая декстрозная среда с добавлением аденина, урацила и аминокислот приводило к ингибированию роста и секреции . Специфическая секреция была в 2,7 раза выше в среде без добавок синтетическая декстроза 7. Сообщения о добавлении к казаминовых кислот 0,5 для улучшения экспрессии ингибитора протеазы в . Синтетическая среда с дрожжевым экстрактом поддерживала более интенсивную секрецию галактозидазы, чем с пептоном 1. Продукция чЭФР рекомбинантными штаммами . Скрининг питательных сред показал, что необогащенная среда с известным химическим составом позволяет производить существенно меньше данного ростового фактора, чем богатая среда, содержащая с казаминовыми кислотами или среда дрожжевой экстракт, пептон, декстроза за часов культивирования 6. Однако, уже через часа культивирования в среде, содержащей с казаминовыми кислотами, большая часть чЭФР деградирует, повидимому, вследствие внеклеточного протеолиза, что, по мнению авторов, служит индикатором нехватки азота, вызывающей гидролиз вакуолей. В среде деградации чЭФР не происходит. Единого мнения о необходимости использования высоких концентраций питательных веществ, витаминов и микроэлементов пока не выработано. Значительное увеличение уровня экспрессии в 5 раз достигалось в ферментере при удвоении концентрации питательных веществ и поддержанием запасов источников углерода и азота 3. Показано, что увеличение концентрации некоторых витаминов биотина, Сапантатената, миоинозитола, пиридоксина I, тиамина I и микроэлементов Си, 2, Мп2, 2 приводило к увеличению клеточного роста, скорости потребления глюкозы и этанола и значительному увеличению выхода . Однако, М. ХШа фактора свертывания крови. Несмотря на то, что фактор ХШа требовал для активации Са2, увеличения его продукции при высоких концентрациях Са2 в среде не наблюдалось.