Эффективность генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клеток-"упаковщиц"

• Автор: Волкова, Людмила Александровна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: п. Дубровицы, Московской обл.
• Количество страниц: 107 с. : ил.

СОДЕРЖАНИЕ
9 ВВЕДЕНИЕ.

1 ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. IО

1.1. Ретровирусные векторы как эффективная система переноса

чужеродных генов в клетки эукариот.

1.1.1. Биологические особенности ретровирусов.

1.1.2. Создание ретровирусных векторов

1.1.3. Пакующие линии клеток

1.1.4. Свойства ретровирусных векторных систем и их

использование для переноса чужеродной ДНК

1.2. Трансгенные животные биореакторы.

1.2.1. Преимущества использование трансгенных животных для
производства рекомбинантных белков.
1.2.2 Продукция рекомбинантных белков в молоко трансгенных
животных.
1.2.3. Использование ретровирусных векторов для получения
трансгенных животных биореакторов
1.3. Получение трансгенной сельскохозяйственной птицы
1.3.1. Использование вирусных векторов для переноса экзогенной
ДНК в эмбриональные клетки птицы.
1.3.2. Микроинъекция ДНК в цитоплазму зиготы
1.3.3. Использование эмбриональных стволовых клеток.
1.3.4. Использование примордиальных зародышевых клеток
2 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ.
2.1. Реактивы и оборудование
2.2. Используемые генные конструкции и пакующие линии
клеток.
2.3. Культивирование клеток.
2.4. Получение первичной культуры клетокмишеней
2.4.1. Получение первичной культуры клеток молочной железы
2.4.2 Получение первичной культуры клеток эмбриона курицы
2.5 Трансформация клетокмишеней i vi
2.5.1. Совместное культивирование с клеткамиупаковщицами.
2.5.2. Инфицирование культуральной жидкостью, содержащей
рекомбинантный ретровирус
2.6. Введение генных конструкций в клеткимишени i viv
2.6.1. Введение генных конструкций в молочную железу
сельскохозяйственных животных
2.6.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур.
2.7. Анализ на наличие генной конструкции ПЦР.
2.8 Анализ экспрессии рекомбинантных белков
2.8.1. Иммуноферментный анализ ИФА
2.8.2. Иммуногистохимия.
2.9. Получение и приготовление препаратов митотических
хромосом кур.
3 РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
3.1 Трансформация клеток молочной железы
сельскохозяйственных животных
3.1.1. Трансфекция клеток молочной железы
сельскохозяйственных животных i vi.
3.1.2. Введение экзогенной ДНК в клетки молочной железы
сельскохозяйственных животных i viv
3.1.3. Иммуногистохимический анализ экспрессии
рекомбинантного ЭПО в молочной железе опытных
животных.
3.1.4. Факторы, влияющие на эффективность трансформации
клеток молочной железы i viv.
3.2. Трансформация клеток эмбрионов кур.
3.2.1. Трансфекция эмбриональных клеток кур i vi
3.2.2. Введение генных конструкций в эмбрионы кур i viv
3.2.2.1 Трансформация клеток эмбрионов кур культуральной
жидкостью
3.2.2.2 Трансформация клеток эмбрионов кур суспензией клеток
упаковщиц
3.2.3. Влияние различных факторов на эффективность
грансформации клеток эмбрионов кур.
3.3. Сравнительный анализ эффективности использования пакующих линий клеток и 3 для трансформации
клетокмишеней i vi и i viv
4 ОБСУЖДЕНИЕ.
5 ВЫВОДЫ.
6 ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
ЛИТЕРАТУРА


Стр. ВВЕДЕНИЕ. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ. Биологические особенности ретровирусов. Трансгенные животные биореакторы. ДНК в эмбриональные клетки птицы. Использование эмбриональных стволовых клеток. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. Культивирование клеток. Совместное культивирование с клеткамиупаковщицами. Введение генных конструкций в эмбрионы кур. Анализ на наличие генной конструкции ПЦР. Иммуногистохимия. Трансформация клеток эмбрионов кур. ОБСУЖДЕНИЕ. ВЫВОДЫ. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ. ЛИТЕРАТУРА. Актуальность темы. Для создания трансгенных животных используют целый ряд методов микроинъекция ДИК в пронуклеус зигот, вирусная трансфекция, использование спермиев как переносчиков ДИК, пересадка ядер трансформированных эмбриональных стволовых клеток, липосомальный транспорт генов Зиновьева, Эрнст, . Исторически более ранним методом является метод микроинъекции ДИК, с использованием которого были получены первые трансгенные сельскохозяйственные животные . . ДНК в зависимости от вида животного наблюдается только в 0,51 случаев Брем и др. Причем около полученных трансгенных животных в последующем не экспрессируют чужеродный белок i I. i . В этой связи актуальным является разработка альтернативных методов переноса генов, позволяющих повысить эффективность трансгенеза. Одним из таких подходов является использование ретровирусных векторных систем. Благодаря эволюционно сложившемуся механизму интеграции вирусной РНК в геном клеткихозяина, ретровирусные векторы позволяют эффективно осуществлять трансформацию клетокмишеней, как i viv, так и i vi. Они самостоятельно проникают в клеткимишени и эффективно интегрируются в ДНК, не разрушая при этом клетку. Огромным преимуществом данных векторов является возможность их использования для получения так называемых соматических трансгенных животных методом локального органного трансгенеза, что позволяет значительно сократить сроки получения трансгенных индивидуумов Титова В. А., Волкова . ., Гвоздь ИМ. ii . v . . . i . . . Однако эффективность трансформации клетокмишеней ретровирусными векторами во многом определяется используемой линией клеток, упаковывающих рекомбинантный ретровирус. В этой связи, возникает необходимость в оценке различных линий клетокупаковщиц для использования в грансгенезе соматических и эмбриональных клеток животных i vi и i viv. Цель и задачи исследования. Исходя из вышеизложенного, целью диссертационной работы явилось исследование эффективности генетической трансформации соматических и эмбриональных клеток животных с использованием различных типов клетокупаковщиц. Провести трансфекцию первичной культуры клеток молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур i vi с использованием двух типов клетокупаковщиц АМ и 3. Изучить динамику экспрессии рекомбинантных белков с молоком соматических трансгенных коров, коз и свиноматок после введения в молочную железу генных конструкций, интегрированных в пакующую линию3. Усовершенствовать метод получения трансгенных кур методом опосредованного ретровирусами переноса генов. ДНК. Выявить факторы, определяющие эффективность трансформации клеток эмбриона кур i viv. Выявлены факторы, определяющие эффективность трансформации эмбрионов кур i viv. Опосредованный ретровирусами перенос генов как эффективный метод доставки экзогенной ДНК в клетки молочной железы сельскохозяйственных животных и эмбрионов кур i vi и i viv. Периодичность синтеза рекомбинантных белков в молоко соматических трансгенных животных. Влияние генной конструкции, пакующей линии клеток и типа вирусного препарата на эффективность трансформации эмбрионов кур i viv. Апробация работы. ВИЖ, гг. Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ.