Принципы получения практически ценных штаммов культивируемых клеток растений методом экспериментального мутагенеза

• Автор: Каранова, Светлана Лаврентьевна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Докторская
• Год защиты: 1999
• Место защиты: Москва
• Количество страниц: 223 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ

СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ВВЕДЕНИЕ

МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ И ОБСУЖДЕНИЕ Глава I Характеристика исходного материала Глава И Получение суспензионной культуры клеток i i .

Глава III Разработка метода массового получения клонов . i

Глава IV Изучение летального и мутагенного действия на культивируемые клетки растений

1. Общая характеристика действия на рост культивируемых клеток растений

2. Изучение действия на каллусную ткань

.i в пассаже после обработки

3. Анализ последействия и селекция в клеточных популяциях .i, растущих на агаризованной питательной среде

4. Изучение суспензионной культуры клеток .i в пассаже после обработки мутагеном

5. Анализ последействия и селекция в суспензионной культуре клеток .i .,, г.

6. Индукция наследственных биохимических изменений соматических клеток i i и ii . Гормононезависимость.
7. Селекция клеточных линий i i, i, i с повышенным содержанием стероидов.
8. Получение мутантных клеточных линий i iv с повышенной активностью пероксидазы.
Глава V Физиологические и биохимические причины
ауксиннезависимости .i и . , индуцированной Глава VI Изучение дыхания в различающихся по биосинтезу стероидов клеточных штаммах .i ЗАКЛЮЧЕНИЕ
ОБЩИЙ ИТОГ ИССЛЕДОВАНИЯ
СПИСОК ШТАММОВ, ПОЛУЧЕННЫХ АВТОРОМ
ЛИТЕРАТУРА


Анализируя рост суспензии клеток определяли их плотность число V клеток в 1мл в гемоцитомстре ФуксаРозенталя. Культуры предварительно мацерировали в хромовой кислоте мин. С. Плотность х расчитывали по формуле х. М3,2 , где М среднее число клеток на камеру из 6ти повторностей. Состав суспензии определяли как соотношение числа отдельных клеток и разных типов агрегатов, выраженное в процензах. Анализировали в каждом варианте не менее 0 культивируемых единиц. Жизнеспособность процент живых клеток оценивали методом прижизненного окрашивания 0,1 синькой Эванса или методом фазовоконтрастной микроскопии. Анализировали в каждом варианте не менее 0 культивирумых единиц. Дли характеристики цитологических и цитогенетических особенностей клеточных популяций культуры фиксировали в смеси этанол уксусная кислота 31 темпорально в течение цикла выращивания. Временные давленные препараты окрашивали насыщенным ацетокармином при ступенчатом нагревании в течение 23 минут в тигле над пламенем спиртовки или ацетоорсеином в течение минут при С. Митотический индекс или процент делящихся клеток определяли на 7 препаратах, при анализе 57 тыс. Соотношение разных типов клеток оценивали на этом же материале. Цитогенетические признаки. Разнообразие клеток по числу хромосом анализировали на временных давленных препаратах. Число хромосом подсчитывали не менее, чем на 0 метафазных пластинках на вариант. Микроскопические наблюдения проводили на микроскопах МБИ3 и iv при увеличениях х и х. Клонирование проводили по методу Бергмана , . Подготовленную суспензию смешивали в отношении 11 с агаризованной питательной средой с 1,6 агара при С и помешали по 2мл в пластиковые чашки Петри диаметром 4см или по мл в чашки Петри диаметром 9см или по Змл в стеклянные чашки Петри диаметром 6см. Селективные среды. Для учета и отбора прототрофных по фитогормонам клеток использовали следующие Среды АК питательная среда без ауксина 2,4Д АК без ауксина и кинетина. В обоих случаях из Среды исключали гидролизат казеина, содержащий триптофан предшественник эндогенных ауксинов. Использовали также питательные Среды, содержащие аналоги аминокислот 5метил0Ьтриптофан v, Германия и рфторфенилалаиин v, Германия. Аналоги добавляли к питательным средам после холодной стерилизации с помощью мембранных фильтров ii, США. Обработка мутагеном. В работе использовали химический мутаген нитрозоИметилмочевину в жидкой питательной среде при рН5,6. Мутаген синтезирован в Институте химической физики РАН, Москва. Маточный раствор стерилизовали фильтрованием через стеклянный фильтр Шотта 35, . , и добавляли асептически к клеточной суспензии. Среды и помещали на агаризованную питательную среду по пробирок на вариант или рассевали в колбы с жидкой питательной средой по 35 колб на вариант, или на чашки Петри после смешивания с агаризованной средой, по 5 чашек на вариант. ИУК и триптофаном по изменению плотности суспензии и жизнеспособности, а также сырой массы клеток. Предварительно клетки отмывали питательной средой без фитогормонов и в течение 3 суток инкубировали на этой среде для истощения гормонального пула. ИУК и предшественники изучали с помощью иСпрепаратов равномерно меченой по углероду кольца антраниловой кислоты, 3СЬтриптофана и 2СИУК. Их асептически, после холодной стерилизации с помощью стеклянного фильтра Шотта, добавляли к суспензии клеток в фазе экспоненциального роста. После ти часовой инкубации суспензию фильтровали и измеряли радиоактивность среды. Затем клеточную массу экстрагировали горячим метанолом, измеряли радиоактивность экстракта и остаточную активность клеточной массы. Экстракт упаривали и разделяли с помощью хроматографии на бумаге в 2у системах растворителей. Для ИУК использовали смесь изопропанол аммиак вода, ИДВ, 11 для антраниловой кислоты и триптофана бутанол уксусная кислота вода, БУВ, 411. Значение Яр в выбранных системах растворителей было для ИУК 0, для антраниловой кислоты 0,0, для триптофана 0,0,.