Разработка технологии изготовления иммуноферментного набора для определения антител к Actinobacillus pleuropneumoniae

• Автор: Шадрова, Наталья Борисовна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2009
• Место защиты: Владимир
• Количество страниц: 136 с.

СОДЕРЖАНИЕ
ВВЕДЕНИЕ

1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ

1.1. Возбудитель плевропневмонии свиней А. р1еигорпечтопш.

1.1.1. История открытия возбудителя и его систематическое положение

1.1.2. Биологические свойства возбудителя

1.1.3. Серологическая дифференциация А.р1еигорпеитотае.

1.2. Роль Л. р1еигорпешпотае в патологии животных

1.2.1. Факторы вирулентности А. реигорпеитотае

1.2.2. Эпизоотологичсские особенности и клинические признаки заболевания.

1.3. Роль серологических методов и иммунофермептного анализа в диагностике актинобациллезной плевропневмонии
1.3.1. Диагностика актинобациллезной плевропневмонии свиней
1.3.2. Иммуноферментный анализ.
1.3.2.1 Непрямой метод ИФА
1.3.2.2 Интерпретация результатов ИФА
1.3.3. Применение ИФА для выявления антител к бактериям
А .р1еигорпеитотае.
1.4. Особенности технологии производства бактериальных
днагностикумов антигенов и диагностических сывороток.
1.5. Заключение по обзору литературы.
2. СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2.1. Материалы
2.1.1. Штаммы и изоляты микроорганизмов
2.1.2. Питательные среды.
2.1.3. Лабораторные животные
2.1.4. Сыворотки.
2.1.5. Растворы и реактивы
2.1.6. Оборудование.1.
2.2. Методы
2.2.1. Методы изучения биологических свойств микроорганизмов
2.2.2. Получение бактериальных антигенов.
2.2.3. Определение активности и специфичности антигенов
2.2.4. Получение нормальных и специфических сывороток крови животных.
2.2.5. Определение серовариаитной принадлежности штаммов
А .р1еигорпеитотае.
2.2.6. Постановка непрямого твердофазного варианта ИФА для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае
.2.2.7. Статистическая обработка результатов.
2.3. Результаты собственных исследований.
2.3.1. Биологические свойства штаммов бактерий А.р1еигорпеипютае, выделенных на территории РФ
2.3.2. Определение серовариантной принадлежности штаммов А.р1еигорпеитотае
2.3.2.1. Определение серовариантной принадлежности штаммов
А.р1еигорпеитотае в РА на стекле.
2.3.2.2. Определение серовариантной принадлежности штаммов
А.р1еигорпеитопше в РДП,
2.3.2.3. Определение серовариантной принадлежности штаммов
А.р1еигорпеитопае в РА.
2.3.3. Выбор антигена А.р1еигорпеитотае для ИФА
2.3.4. Разработка иммупоферментной тестсистемы для определения
антител к бактериям А.р1еигорпеитотае
2.3.4.1. Оптимизация условий постановки непрямого варианта ИФА
2.3.4.2. Определение оптимальных разведений антигена и конъюгата
2.3.4.3. Получение комбинированного антигена.
2.3.4.4. Выбор условий хранения комбинированного антигена на планшетах
2.3.4.5 Сравнительная оценка результатов выявления антител к бактериям А.р1еигортитопюе в непрямом варианте ИФА и в РА.
2.3.4.6. Разработка иммуноферментной тестсистемы для выявления антител к бактериям А.р1еигорпеитотае при тестировании сывороток крови свиней в одном разведении.
2.3.4.6.1. Определение рабочего разведения сыворотки крови свиней и расчет титра антител
2.3.4.6.2. Определение допустимых величин оптической плотности для контрольных положительной и отрицательной сывороток.
2.3.4.6.3. Определение позитивно негативного порога.
2.3.4.6.4. Сравнение чувствительности и специфичности разработанной иммуноферментной тестсистемы с РА и коммерческим набором ИФА
2.3.5. Иммунологический мониторинг свииопоголовья в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии на свинокомплексах Российской Федерации
2.3.5.1. Определение динамики накопления поствакцинальных антител
2.3.5.2. Серологический мониторинг в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии на свинокомплексах РФ, проведенный с применением разработанных наборов ИФА.
2.3.6. Технологическая схема производства иммуноферментных наборов для определения антител к бактериям А.реигорпеитотае.
3. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ ИССЛЕДОВАНИЙ
4. ВЫВОДЫ
5. ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
6. СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ
7. ПРИЛОЖЕНИЯ
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность


Особенностью данного заболевания является возможное субклиническое течение инфекции часто после лечения антибиотиками а также бактерионосительство, без внешних проявлений болезни, которое представляет потенциальную опасность при формировании нового, смешанного стада , , . В таком случае вспышка происходит внезапно, болезнь носит острый характер, часто с привлечением сопутствующей микрофлоры, что влечет за собой значительный экономический ущерб. Поэтому выявление серопозитивных животных является важным звеном в противоэпизоотических мероприятиях при данном заболевании , , . НС и Северной Америке широкое распространение нашли методы выявления антител с помощью, как традиционных серологических реакций, так и иммуноферментного анализа. В Канаде и Дании серологические методы используют для эпидемиологического надзора за поголовьем свиней , , , 2, 3, 8. Разработка иммунохимических методов, в частности ИФА, расширила возможность выявления специфических антител к возбудителям бактериальных инфекций, открыла перспективы устранения многих технических проблем лабораторной диагностики и повышения ее стандартизации и достоверности 4, 6, 7, 1, 8, 9. Являясь одним из сравнительно молодых методов, базирующихся на использовании антител, конъюгированных с различными ферментами, ИФА по многим параметрам превосходит традиционные методы диагностики по чувствительности, специфичности и производительности, быстроте получения результатов, возможности стандартизации условий постановки анализа, доступности широкому кругу практических учреждений 9, 3. Указанные преимущества этого метода, способствовали его выбору для изучения возможности использования в качестве метода выявления и количественного определения антител к бактериям . Кроме того, важным аспектом в диагностике актииобациллезной плевропневмонии является определение ссровариантпого состава циркулирующих в хозяйствах изолятов . До настоящего времени в РФ отсутствовали коммерческие диагиостикумы для выявления антител в сыворотках крови свиней к бактериям . Цели и задачи исследования. Целью наших исследований была разработка иммуноферментной тест системы для выявления антител против бактерий Л. Ыигорпеитотае в сыворотках крови свиней. А.р1еигорпеитотае микрометодом и изучить возможность использования е для серотипирования выделенных изолятов бактерий А. Российской Федерации. Практическая значимость. Экспериментальные данные диссертационной работы явились основой для разработки методических рекомендаций по получению специфических компонентов для постановки РА и ИФА. Разработана нормативная документация на набор для выявления антител к бактериям АатоЪасШт р1еигорпеитотае в сыворотках крови свиней иммуиоферментиым методом. А.ренгирпеитстав применяется в ФГУ ВНИИЗЖ при исследовании сывороток крови свиней. Публикации научных работ. По материалам диссертации опубликовано 6 научных работ, одна из них в издании по перечню ВАК РФ. Апробация работы. Основные материалы диссертации доложены и получили положительную оценку на заседаниях Ученого Совета ФГУ ВНИИЗЖ в гг, на Международных научнопрактических конференциях Проблемы мониторинга и генодиагностики инфекционных болезней животных Владимир. Достижения молодых ученых в ветеринарную практику, Владимир, г. Объм и структура диссертации. Диссертация изложена на 6 страницах, иллюстрирована таблицами и рисунками. Список использованной литературы включает 6 источников, из них 9 иностранных. Основные положения, выносимые на защиту. А.ркигорпеипютае при определении динамики накопления поствакцималыгых антител и проведении серологического мониторинга в отношении возбудителя актинобациллезной плевропневмонии свиней. Возбудитель плевропневмонии свиней Л. Актннобациллезная плевропневмония свиней ото инфекционная контагиозная болезнь, которая характеризуется при остром течении геморрагическим воспалением легких и фибринозным плевритом, а при подостром и хроническом развитием очаговой гнойной некротизирующей плевропневмонии и фибринозным плевритом , , , , , , , . Возбудителем актинобациллезной плевропневмонии свиней является АсИпоЬасШт рЫигорпеитотае грамотрицательная, капсулообразующая гемофильная бактерия .