Использование репортёрных генов (GFP и LacZ) для изучения эффективности генетической трансформации животных

• Автор: Покровская, Мария Владимировна
• Шифр специальности: 03.00.23
• Научная степень: Кандидатская
• Год защиты: 2005
• Место защиты: п. Дубровицы, Московской обл.
• Количество страниц: 140 с. : ил.

ОГЛАВЛЕНИЕ
ВВЕДЕНИЕ.

1. ОБЗОР ЛИТИРАТУРЫ

1.1. Использование промоторной области регуляторных генов в экспериментах по генетической трансформации.

1.1.1. Экспрессия стрессовых белков белков теплового шока

1.1.1.1. Промоторный район гена белка теплового шока БТШ

в экспериментах по трансформации эукариотических клеток

1.1.2. Тканеспецифическая экспрессия генов медленной эстеразы у насекомых

1.1.3. Регуляция экспрессии генов кератина волос у млекопитающих

1.2. Репортрные гены маркеры генетической трансформации

1.2.1. Ген галактозидазы ii i

1.2.2. Флуоресцирующие белки кишечнополостных.
1.2.2.1. Зелный флуоресцирующий белок vii
1.2.2.1.1. Особенности пространственной структуры .
1.2.2.1.2. Хромофор .
1.2.2.1.3. Спектральные характеристики и его мутантных форм
1.2.2.1.4. Физикохимические свойства .
1.3. Генетическая трансформация насекомых.
1.3.1. Первые эксперименты но трансгенезу насекомых.
1.3.2. Мобильные элементы векторы генетической трансформации насекомых
1.3.2.1. Характеристика мобильных элементов.
1.3.2.2. элемент дрозофилы
1.3.2.2.1. Механизм интеграции мобильных элементов в хромосомы
насекомых на примере Рэлемснта
1.3.2.2.2. Трансформация насекомых с помощью Рэлементов
1.3.2.3. Мобильный элемент эффективный вектор для трансформации насекомых
1.3.3. Микроинъекция эмбрионов основной метод трансформации насекомых.
1.3.4. Маркеры генетической трансформации насекомых.
1.3.4.1. эффективный маркер генетической трансформации у насекомых
1.3.5. Генетическая трансформация комнатных мух.
1.3.6. Мутагенное действие экзогенной ДНК.
1.4. Получение трансгенных мышей
2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
2.1. Объекты исследований .
2.2. Схемы исследований.
2.3. Использованные векторы.
2.4. Получение генетически трансформированных животных
2.4.1. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух
2.4.1.1. Микроипъектор и микроинструменты.
2.4.1.2. Проведение микроинъекции эмбрионов комнатных мух
2.4.1.3. Получение потомства от комнатных мух, микроинъецированных на эмбриональной стадии
2.4.2. Получение трансгенных мышей
2.5. Молекулярно генетический анализ
2.5.1. Выделение ДНК
2.5.2. ПЦРанализ.
2.5.2.1. Праймеры.
2.6. Анализ экспрессии чужеродных генов у трансформированных животных
2.6.1. Выявление продуктов экспрессии гена галактозидазы . i.
у комнатных мух
2.6.2. Выявление экспрессии гена зелного флуоресцирующего
белка . vii
2.6.2.1. Выявление экспрессии гена у комнатных мух.
2.6.2.2. Выявление экспрессии гена у мышей.
2.6.2.2.1. Определение флуоресценции у трансгенных мышей
2.6.2.2.2. Иммуногистохимическое выявление экспрессии гена
3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ.
3.1. Результаты микроинъекций эмбрионов комнатных мух.
3.1.1. Получение и разведение взрослых комнатных мух,
микроинъецированных на эмбриональной стадии плазмидами и 7i
3.1.1.1. Результаты определения бетагалактозидазной активности у потомков i ., микроинъецированных на эмбриональной стадии
3.1.1.2. Анализ наследования формы крыльев у комнатных мух
3.1.1.3. Сравнение жизнеспособности комнатных мух линии с нормальными прямыми крыльями и мух линии
3.1.1.4. Аллелизм мутации у комнатных мух.
3.1.1.5. Молекулярный анализ хромосомной ДНК комнатных мух мутантной линии .
3.1.2. Микроинъекция эмбрионов комнатных мух плазмидами
и I.
3.1.2.1. Исследование экспрессии гена у комнатных мух
3.1.2.2. Молекулярный анализ ДНК комнатных мух, на содержание последовательностей рекомбинантных мобильных элементов
3.1.2.3. Анализ ДНК комнатных мух на содержание эндогенных элементов
3.2. Получение трансгенных мышей
3.2.1. Получение первичных трансгенных мышей
3.2.2. Получение первого и второго поколения трансгенных мышей
3.2.3. Анализ экспрессии гена зелного флуоресцирующего белка vii у трансгенных мышей.
3.2.3.1. Исследование флуоресценции волос у трансгенных особей.
3.2.3.2. Исследование флуоресценции гистологических препаратов кожи трансгенных мышей
3.2.3.3. Иммуногистохимическое исследование ткансспецифической экспрессии гена .
ОБСУЖДЕНИЕ.
ВЫВОДЫ.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ.
Список опубликованных работ по теме диссертации
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ


Возможность использования репортрного гена под контролехМ промотора гена и промотора Кег5 для изучения эффективности генетической трансформации модельных животных i . Локализация экспрессии гена в корковом веществе волос у мышей, трансгенных по . Отклонение фактического расщепления по трансгену в первом поколении и подтверждение менделевского расщепления по тому же трансгену во втором поколении трансгенных мышей. В результате проведнных исследований показана принципиальная возможность использования гена зеленого флуоресцирующего белка медузы vii в качестве селективного маркера для отбора трансгенных комнатных мух на эмбриональной стадии развития. Тканеспецифическая экспрессия гена улучшенного зелного флуоресцирующего белка БвРР, наблюдаемая у трансгенных мышей, обуславливает возможность использования промоторной области гена К2. Материалы диссертации были изложены на й научной конференции молодых учных и аспирантов ВГНИИЖа Достижения молодых учных в области животноводства, проходящей 6 июля года в ВГНИИЖе, п. Дубровицы, Подольского района, Московской области на отчтных научных конференциях отдела биотехнологии ВГНИИЖа , , , года. Диссертация включает 8 таблиц и рисунков. Список использованной литературы состоит из 9 источников. В клетках всех типов живых организмов растений, бактерий, грибов, животных и человека при увеличении температуры на 8 С выше нормальной происходит синтез специфического набора белков, называемых белками теплового шока i, . Они помогают клетке выжить в условиях температурного стресса и вернуться после его прекращения к нормальной жизни i , . В году i . С происходит характерное при активации генов образование пуфов вздутий на политенных хромосомах слюнных желз личинок дрозофилы. Этот процесс наблюдался в тех участках, где разрыхление структуры хроматина и накопление синтезирующихся молекул РНК не происходит при нормальной температуре i . Белки, кодируемые генами теплового шока, были описаны позднее, в году ii . Белки теплового шока БТШ у всех организмов представлены большим набором полипептидов, и называются в соответствии с их молекулярной массой, выраженной в килодальтонах кД. Например, БТШ с молекулярной массой кД называют БТШ . БТШ играют существенную роль в жизни клеток. Об этом свидетельствует их высокая консервативность в эволюции. Например, БТШ имеет высокое сходство аминокислотной последовательности у насекомых, птиц, млекопитающих, грибов и растений. Отдельные участки в БТШ сохраняют свыше гомологии у бактерий и человека Кулаева О. Н., . Было установлено, что синтез различных происходит при разной температуре. Так у тыквы, синтез высокомолекулярных БТШ был активирован в диапазоне С, ослабевал при С и резко снижался при С. Индукция синтеза низкомолекулярных БТШ была особенно большой при С. В клетках дрозофилы выделяют три семейства генов, кодирующих стрессовые белки белки теплового шока v . Повторяющиеся гены БТШ и уникальный ген БТШ. Ген с единственной копией БТШ. Группа связанных генов низкомолекулярных БТШ. Белки семейства белков теплового шока с молекулярной массой тыс. У дрожжей семейство БТШ кодируется девятью генами, из которых шесть усиливают экспрессию при тепловом шоке, два снижают, а один не реагирует на тепловой шок. У дрозофилы один из БТШ индуцируется тепловым шоком, а семь других экспрессируются при нормальной температуре Кулаева О. Н., . В середине х годах появился прогресс в понимании биологической роли этих белков. Было обнаружено, что основной функцией белков теплового шока является обеспечение правильного характера сворачивания полипептидных цепей в нативную структуру. БТШ присоединяется к другим белкам, вызывая их разворачивание и препятствуя их агрегации, которая помешала бы белку приобрести нативную конформацию, необходимую для его функциональной активности Наградова Н. К., . Разворачивание белков с помощью БТШ необходимо для проникновения этих структур через мембраны различных органелл клетки хлоропластов, митохондрий и эндоплазматического ретикулума. Агрегация белков резко усиливается при повышении температуры. Активация синтеза в этих условиях БТШ защищает белки от необратимого повреждения.